第十一章-荧光法解析优秀PPT.ppt

第十一章第十一章 荧光分析法荧光分析法 Fluoreometry荧光荧光11/5/2022 2:29:01 PM :/chemcenter.tongji.edu/bbs荧光的产生荧光的产生放射与激发光谱放射与激发光谱荧光仪器荧光仪器定量关系定量关系荧光效率荧光效率概述概述 用荧光来进行定性定量的分析方法用荧光来进行定性定量的分析方法荧光分析法。荧光分析法。无辐射跃迁放出热能或动能物质基态光照射激发态光致发光发射荧光和磷光物质基态吸收特定光可见可见-紫外光源紫外光源 分子荧光分析分子荧光分析 由荧光波长可确定物质分子结构由荧光波长可确定物质分子结构 由荧光强度可测物质的含量由荧光强度可测物质的含量 1 荧光分析法基本原理 一、分子荧光（一）、分子荧光的产生 分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，由此再跃回基态或基态中其它振动能级时所发出的光。基态和激发态基态和激发态单重态和三重态单重态和三重态辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）概概 念念 单重态：singlet state 三重态：triplet state电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋量子数续前A B C单重态和三重态电子分布单重态和三重态电子分布能 量 *A：基态单重态 B：激发单重态 C：激发三重态激发三重态T激发单重态S*基态单重态S0激发单重态激发单重态S与激发三重态与激发三重态T的不同点：的不同点：1.能量高能量高2.激发单重态激发单重态平均寿命短平均寿命短，tS=10-8s,3.基态单重态到激发单重态基态单重态到激发单重态的激发为的激发为允许允许跃迁跃迁1.能量低能量低2.激发三重态激发三重态平均寿命长平均寿命长，tS=10-4-1s,3.基态单重态到激发三重态基态单重态到激发三重态的激发为的激发为禁阻禁阻跃迁跃迁激发单重态激发单重态S激发三重态激发三重态T回基态途经回基态途经荧荧 光光 形形 成成 机机 制制单重态单重态其其次次激激发发态态第第一一激激发发态态三重态三重态荧荧光光磷磷光光内转换内转换体系体系跨越跨越振振动动弛弛豫豫基基态态振振动动弛弛豫豫荧光荧光磷光磷光处于第一电子激发处于第一电子激发单重态最低振动能单重态最低振动能级的分子放射光量级的分子放射光量子回到基态各振动子回到基态各振动能级，这一过程为能级，这一过程为荧光放射荧光放射处于第一电子激发处于第一电子激发三重态最低振动能三重态最低振动能级的分子放射光量级的分子放射光量子回到基态各振动子回到基态各振动能级，这一过程为能级，这一过程为磷光放射。磷光放射。不同点不同点起源不同起源不同波长不同波长不同寿命不同寿命不同吸吸取取峰峰磷磷光光峰峰荧光峰荧光峰(二二)、荧光的激发和放射光谱、荧光的激发和放射光谱激发波长放射波长&激发光谱(excitation spectrum)：F ex&荧光光谱(fluorescence spectrum)：F em光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器荧光光谱固定放射波长，固定放射波长，变更激发波长，变更激发波长，测荧光强度和激测荧光强度和激发光波长的关系。发光波长的关系。固定激发波长，固定激发波长，（为最大激发波为最大激发波长），长），测不同测不同波长时的荧光强波长时的荧光强度。度。荧光的激发光谱和放射光谱荧光的激发光谱和放射光谱激发光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光放射光谱荧光放射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱Stokes位移：位移：荧光波长一般比激发波长要长荧光波长一般比激发波长要长(前者能量较低前者能量较低)荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。蒽的激发光谱和荧光光谱S0S1*=4=3=2=1=0=4=3=2=1=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E1E4E3E2E1蒽的能级跃迁图镜像关系的缘由镜像关系的缘由基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似返回 荧光产生的必要条件荧光产生的必要条件 有吸取结构有吸取结构有高的有高的荧光效率荧光效率二、二、荧光与分子结构荧光与分子结构（一）（一）、荧光效率（、荧光效率（fluorescence efficiencyfluorescence efficiency）分子结构与荧光的关系长共轭结构长共轭结构分子的刚性取代基类型共轭高荧共轭高荧光效率高光效率高刚性平面使刚性平面使荧光效率高荧光效率高1、给电子基团使荧光增加-OH,-OCH3,-NH2,-CN,-NR2;2、吸电子基团使荧光减弱-COOH,-NO2,-SH,-C=O,-X;3、-R,-SO3H,-NH3+等基团对荧光影响不明显。共轭效应共轭效应共轭效应共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大大，离域大大，离域大大，离域大键的电子越简洁激发，荧光越简洁产生。键的电子越简洁激发，荧光越简洁产生。键的电子越简洁激发，荧光越简洁产生。键的电子越简洁激发，荧光越简洁产生。化合物化合物化合物化合物苯苯苯苯萘萘萘萘蒽蒽蒽蒽丁丁丁丁 省省省省戊戊戊戊 省省省省 exexmaxmax(nm)(nm)205205286286365365390390580580 ememmaxmax (nm)(nm)278278321321400400480480640640 F F0.10.11 10.290.290.460.460.600.600.620.62荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光放射。荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光放射。荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光放射。荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光放射。刚性平面结构刚性平面结构刚性平面结构刚性平面结构芴芴芴芴联苯联苯联苯联苯 F F=1=1 F F=0.2=0.2荧光黄荧光黄荧光黄荧光黄不产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光 F F=0.92=0.92荧光黄荧光黄荧光黄荧光黄酚酞酚酞酚酞酚酞偶氮菲偶氮菲偶氮菲偶氮菲偶氮苯偶氮苯偶氮苯偶氮苯1 1）给电子取代基加强荧光）给电子取代基加强荧光）给电子取代基加强荧光）给电子取代基加强荧光.取代基效应取代基效应取代基效应取代基效应HNHN2 2，NHR NHR，NRNR2 2，OH OH，OR OR，CN CN产生产生产生产生 p p 共轭共轭共轭共轭二苯甲酮：弱荧光二苯甲酮：弱荧光二苯甲酮：弱荧光二苯甲酮：弱荧光S S1 1 T T1 1的的的的系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近系间窜跃产率接近1 1化合物化合物化合物化合物苯苯苯苯苯酚苯酚苯酚苯酚苯胺苯胺苯胺苯胺苯基氰苯基氰苯基氰苯基氰苯甲醚苯甲醚苯甲醚苯甲醚 ememmax max(nm(nm）278310278310285365285365310405310405280390280390285345285345相对荧光强度相对荧光强度相对荧光强度相对荧光强度101018182020202020202 2）吸电子取代基减弱荧光）吸电子取代基减弱荧光）吸电子取代基减弱荧光）吸电子取代基减弱荧光C=OC=O，COOH COOH，NONO2 2不产生不产生不产生不产生 p p 共轭共轭共轭共轭硝基苯：不产生荧光硝基苯：不产生荧光硝基苯：不产生荧光硝基苯：不产生荧光.金属螯合物的荧光1.1.螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉弱荧光弱荧光弱荧光弱荧光8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉-Zn-Zn螯合螯合螯合螯合物物物物黄绿色强荧光黄绿色强荧光黄绿色强荧光黄绿色强荧光2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯无荧光无荧光无荧光无荧光2,2-2,2-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯-Al-Al螯合物螯合物螯合物螯合物强荧光强荧光强荧光强荧光三、影响荧光强度的外部因素 A、温度影响 温度上升，荧光减弱 B、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增加 含重原子的溶剂（e.g.CBr4）使荧光减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱 C、酸度的影响 D、荧光熄灭剂 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消逝。.E、散射光.散射光干扰及消退散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分被吸取或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向变更，而向不同方向散射形成的光。散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光：无能量的交换，散射激发拉曼光：有能量转移，散射 激发硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱与散射光谱(b)荧光光谱荧光光谱散射光谱散射光谱瑞利光瑞利光320nm拉曼光拉曼光360nm拉曼光拉曼光400nm荧光荧光448nm激发激发320nm320nm激发激发350nm瑞利光瑞利光350nm干扰的消退干扰的消退1 1）变更激发光的波长；）变更激发光的波长；2 2）更换溶剂；）更换溶剂；CCL4CCL4的拉曼光与激发的拉曼光与激发光波长相近，其拉曼光几乎不干扰荧光波长相近，其拉曼光几乎不干扰荧光测定。光测定。2 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系 I0 I F 在在ECl0.05时时，F=K C,溶液的荧光强度与溶液中荧光溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；物质的浓度呈线性关系；在在ECl0.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；度不呈线性关系；荧光分析法的测定灵敏度高。荧光分析法的测定灵敏度高。三三三三.分子荧光强度与荧光物质浓度的关系分子荧光强度与荧光物质浓度的关系分子荧光强度与荧光物质浓度的关系分子荧光强度与荧光物质浓度的关系1.1.荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系光吸取定律（光吸取定律（光吸取定律（光吸取定律（Lambert Beer LawLambert Beer Law）相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：荧光强度（荧光强度（荧光强度（荧光强度（I IF F）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：依据级数绽开式：依据级数绽开式：依据级数绽开式：依据级数绽开式：对于稀溶液，当对于稀溶液，当对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bc bc0.0.0505时：时：时：时：I IF F-荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度 F F-荧光量子产率荧光量子产率荧光量子产率荧光量子产率k k-与仪器灵敏度有关的参数与仪器灵敏度有关的参数与仪器灵敏度有关的参数与仪器灵敏度有关的参数I I0 0-入射光强度。入射光强度。入射光强度。入射光强度。l-l-吸取光程吸取光程吸取光程吸取光程-摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数C-C-荧光物质浓度荧光物质浓度荧光物质浓度荧光物质浓度通常 A0.05If与A 的关系A与c正比，低浓度泰勒级数绽开，仅取一项，x越小越符合定量关系荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用一一一一.工作曲线法工作曲线法工作曲线法工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高10103 310104 4.干脆荧光标准曲线法干脆荧光标准曲线法干脆荧光标准曲线法干脆荧光标准曲线法F FC Cs sF Fx xC Cx x二二二二.荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度荧光分析法的灵敏度比例法比例法分光法与荧光法定量比较 UV-VISUV-VIS分光法分光法 荧光法荧光法定量基础定量基础 A=lgIA=lgI0 0/I F/I F C C灵敏度灵敏度 与与 有关有关 与与 有关有关检测限检测限 1010-6-6-10-10-9-9 10 10-9-9-10-10-12-12 灵敏度高选择性好灵敏度高选择性好垂直方向3 荧光光度计 光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器 与分光光度计的主要差别与分光光度计的主要差别 垂直测量方式垂直测量方式,消退透射光影响消退透射光影响 两个单色器，激发和放射，常用光栅两个单色器，激发和放射，常用光栅荧光仪特点荧光仪特点一一一一.光源光源光源光源1.1.光源的要求：光源的要求：光源的要求：光源的要求：vv放射强度足够且稳定的连续光谱放射强度足够且稳定的连续光谱放射强度足够且稳定的连续光谱放射强度足够且稳定的连续光谱vv光辐射强度随波长的变更小光辐射强度随波长的变更小光辐射强度随波长的变更小光辐射强度随波长的变更小vv有足够长的运用寿命有足够长的运用寿命有足够长的运用寿命有足够长的运用寿命2.2.氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源高压汞光源高压汞光源波长范围：波长范围：波长范围：波长范围：2001000nm2001000nm工作压力：工作压力：工作压力：工作压力：520 atm520 atm启动电压：启动电压：启动电压：启动电压：2040KV2040KV运用寿命：运用寿命：运用寿命：运用寿命：10002000h10002000h最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：最广泛应用的连续光源：放射波长范围宽放射波长范围宽放射波长范围宽放射波长范围宽 放射光强度大放射光强度大放射光强度大放射光强度大二二二二.单色器：两个单色器：两个单色器：两个单色器：两个三三三三.检测器检测器检测器检测器光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管 放大倍数：放大倍数：放大倍数：放大倍数：2 2 2 2n n n n 5 5 5 5n n n n;n=10,10;n=10,10;n=10,10;n=10,103 3 3 3 101010107 7 7 7，最大最大最大最大101010108 8 8 8 101010109 9 9 9四四四四.样品池样品池样品池样品池1.1.形态：紫外形态：紫外形态：紫外形态：紫外-可见分光光度计的吸取池两面透光可见分光光度计的吸取池两面透光可见分光光度计的吸取池两面透光可见分光光度计的吸取池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围波长范围波长范围波长范围2.2.运用留意事项运用留意事项运用留意事项运用留意事项简洁裂开简洁裂开简洁裂开简洁裂开问题：紫外问题：紫外问题：紫外问题：紫外-可见分光光度计的吸取池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸取池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸取池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸取池与荧光分光光度计的样品池有什么区分？样品池有什么区分？样品池有什么区分？样品池有什么区分？沾污问题沾污问题沾污问题沾污问题2.放射单色器：置于样品池后和检测器之间1.激发单色器：置于光源和样品池之间，其作用是供应所须要的单色光，以激发被测物质。紫外-可见分光光度计测量池(吸取池)荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池样品池样品池I0ItI0ItIF,p4 分子荧光分析法的在药学中的应用1.1.无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试剂形成荧光络合物而被测定；剂形成荧光络合物而被测定；2.2.一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定；一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定；3.3.脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有机试剂反应后生成会放射荧光的衍生物加以测定；机试剂反应后生成会放射荧光的衍生物加以测定；4.4.芳香族化合物因有共轭结构，多数能放射荧光；芳香族化合物因有共轭结构，多数能放射荧光；5.5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成强荧光衍生物以提高测量灵敏度。强荧光衍生物以提高测量灵敏度。故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚广。广。芳芳芳芳香香香香族族族族化化化化合合合合物物物物存存存存在在在在共共共共轭轭轭轭的的的的不不不不饱饱饱饱和和和和体体体体系系系系，是是是是有有有有机机机机化化化化合合合合物物物物荧荧荧荧光光光光测测测测定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。定的主要类型。1.荧光和磷光在产朝气制上有什么不同？荧光和磷光在产朝气制上有什么不同？2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（以下物质中可能有最强荧光的物质是（）。）。思思 考考 题题4.荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是().A.激发光激发光;B.磷光磷光;C.拉曼光拉曼光;D.容器表面产生的散射光容器表面产生的散射光5 测量荧光强度时测量荧光强度时,要在与入射光成直角的方向测量要在与入射光成直角的方向测量,这是这是因为因为().A.只有在与入射光成直角的方向上才有荧光只有在与入射光成直角的方向上才有荧光;B.在成直角方向测量可以避开散射光的影响在成直角方向测量可以避开散射光的影响;C.在成直角方向测量可免除透射光的影响在成直角方向测量可免除透射光的影响;D.荧光的强度比入射光强荧光的强度比入射光强6.（）荧光光谱形态与激发光的波长无关。（）荧光光谱形态与激发光的波长无关。7.荧光光谱的特征？荧光光谱的特征？1.所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸取了入射光的能量，从而辐所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸取了入射光的能量，从而辐射出比入射光射出比入射光()。A.波长长的光线波长长的光线 B.波长短的光线波长短的光线 C.能量大的光线能量大的光线 D.频率高的光线频率高的光线2.下列说法正确的是下列说法正确的是()A 荧光放射波长恒久大于激发波长荧光放射波长恒久大于激发波长 B 荧光放射波长恒久小于激发波长荧光放射波长恒久小于激发波长 C 荧光光谱形态与激发波长无关荧光光谱形态与激发波长无关 D 荧光光谱形态与激发波长有关荧光光谱形态与激发波长有关3荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是()A.单色光单色光 B.ECl0.05 C.入射光强度入射光强度I0确定确定 D.样品池厚度确定样品池厚度确定推断题推断题1荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光光谱。中具有相同的荧光光谱。2荧光光谱的形态与激发光谱的形态常形成镜像对称。荧光光谱的形态与激发光谱的形态常形成镜像对称。3在确定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关在确定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。即：系。即：4.荧光光谱的形态与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到荧光光谱的形态与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。最佳荧光光谱。5荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光 路为一路为一条直线。条直线。细胞标记细胞标记用量子点检测肿瘤细胞用量子点检测肿瘤细胞