实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳教学教材.ppt

实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析实验原理实验原理 电泳：电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。反的电极移动的现象。在一定在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。以蛋白质为例：以蛋白质为例：HOHHOHpHpI pH=pI pHpI影响电泳迁移率的因素：影响电泳迁移率的因素：1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋白的大小和形状蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离值、溶液的离 子强度和电渗现象子强度和电渗现象常见的电泳有：常见的电泳有：1 1、醋酸纤维膜电泳、醋酸纤维膜电泳、2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、3、毛细管电泳、毛细管电泳负极负极正极正极 表面带负电荷表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向带正电荷的水层携带粒子向负极移动负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。移向正极的，则泳动的速度减慢。电渗作用：电渗作用：电渗：电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。以纸电泳为例以纸电泳为例:血清中几种主要蛋白组分：血清中几种主要蛋白组分：血清蛋白质血清蛋白质等电点等电点分子量分子量占总蛋白的占总蛋白的清蛋白清蛋白 4.644.6469,00069,000575772 72 1 1球蛋白球蛋白 5.005.00200,000200,0002 25 52 2球蛋白球蛋白 5.065.06300,000300,0004 49 9球蛋白球蛋白 5.125.1290,00090,000150,000150,0006.56.51212球蛋白球蛋白 6.856.857.3 7.3 156,000156,000950,000950,00012122020v 缓冲液缓冲液pH=8.6pH=8.6v pIpIpHpH血清蛋白血清蛋白带负电荷带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜作为支持介质 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为为为为0.10.10.15mm0.15mm染色剂染色剂一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红春红春红春红 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff-Schiff试剂试剂试剂试剂 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色 实验器材实验器材1、电泳仪及电泳槽、电泳仪及电泳槽2、醋酸纤维薄膜（、醋酸纤维薄膜（28cm）3、培养皿、培养皿4、点样器（盖玻片）、点样器（盖玻片）5、滤纸、滤纸6、玻璃板（可用大培养皿背面代替）、玻璃板（可用大培养皿背面代替）7、镊子、镊子8、毛细管、毛细管9、刀片、刀片实验试剂实验试剂1、巴比妥、巴比妥-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离，离子强度子强度0.06)2、0.5%氨基黑氨基黑10B染色液染色液3、漂洗液、漂洗液100ml4、透明甲液和乙液各、透明甲液和乙液各20ml5、人血清（严格防止血清沾到皮肤上，尤其是带有、人血清（严格防止血清沾到皮肤上，尤其是带有伤口的皮肤）伤口的皮肤）实验操作实验操作1.1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。2.2.电泳槽的准备电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成滤纸桥。3.3.点样：点样：点样前，取一张干净的滤纸，在距一边点样前，取一张干净的滤纸，在距一边1.5cm处用铅处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。笔划一条平行线作为点样标志区。点样时，用毛细管吸取血清，在盖玻片一端均匀涂抹，点样时，用毛细管吸取血清，在盖玻片一端均匀涂抹，使样品连续、均匀、适量，把盖玻片在薄膜毛面上轻而温使样品连续、均匀、适量，把盖玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。（见图）。此步是实验的关键。此步是实验的关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线黑线处为点样位置）处为点样位置）点样区点样区6.5cm1.5cm4.4.电电 泳泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度电流强度0.3mA/cm膜宽度（膜宽度（8片薄膜则为片薄膜则为4.8mA）。通电）。通电10-15min后，调节电流强度后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度（膜宽度（8片薄膜则片薄膜则为为8mA），电泳时间），电泳时间50-80min。电泳后，调节旋钮使电流。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。为零，关闭电泳仪切断电源。5.5.染色：染色：电泳完毕后将薄膜取下电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑放在含氨基黑10B10B染色液的染色液的培养皿中浸泡培养皿中浸泡5min5min，染色时可置于摇床，染色液用后回收，染色时可置于摇床，染色液用后回收到原瓶。到原瓶。6.6.漂洗：漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹风机冷风吹干或者自然晾干。用吹风机冷风吹干或者自然晾干。7.7.透明透明 将干燥的薄膜浸入透明甲液将干燥的薄膜浸入透明甲液2min2min后转入乙液后转入乙液1min1min，取，取出后贴于干净玻璃板上，中间不能有气泡，等待至薄膜透出后贴于干净玻璃板上，中间不能有气泡，等待至薄膜透明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷风吹干燥，明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷风吹干燥，置于自来水下冲洗，等薄膜湿润后用刀片从一角撬开并轻置于自来水下冲洗，等薄膜湿润后用刀片从一角撬开并轻轻取下，滤纸吸干水分后即可。如需长期保存可在液体石轻取下，滤纸吸干水分后即可。如需长期保存可在液体石蜡中浸润。蜡中浸润。8.8.记录和分析实验结果记录和分析实验结果 透明后可将薄膜上的透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜的薄膜可作扫描或照相。可作扫描或照相。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，为清蛋白，2，3，4，5，分别为，分别为1，2，及，及球蛋白，球蛋白，6为点样为点样原点原点 注意事项注意事项1 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量以不干不湿为宜。吸水量以不干不湿为宜。3 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。过少。5 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。面向下。6 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。行复染。思考题思考题1.1.用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？优点？2.2.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？3.3.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？作？小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义可能相关疾病可能相关疾病清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白骨髓瘤骨髓瘤*肾病综合症肾病综合症*肾炎肾炎*肝硬化肝硬化*急性肝坏死急性肝坏死*传染性肝炎传染性肝炎*急性感染初期急性感染初期*慢性炎症慢性炎症/感染后期感染后期*低低 球蛋白血症球蛋白血症*此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢