分子生物学常用核酸分子探针简介.ppt
分子生物学常用核酸分子探针简介 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望写在前面 经典化学分析：沉淀剂、滴定剂、萃取 剂、指示剂和显色剂等发展方向：微型化、仿生化、自动化、信息化 目前最高水平：DNA序列分析中标记碱基的四种分子荧光探针 微型化：纳米芯片、生物芯片及芯片上的实验室 仿生化：电子鼻和电子舌的传感器 自动化：原位及体内实时在线检测 信息化:临床、环境及生产过程检测的网络化 生物分子探针生物分子探针 l主要类型：离子探针离子探针 蛋白质及酶的荧光探针蛋白质及酶的荧光探针 核酸分子荧光探针核酸分子荧光探针 离子探针？什么东东啊？将生物大分子中的非过渡族金属离子用具有光、磁信息的过渡族金属离子置换，用这些金属离子与生物大分子的相互作用行为探查非过渡金属的生物功能，即为离子探针技术。这样就能 对溶剂状态中生物分子构象和行为进行研究，弥补了X射线衍射方法只能对晶体进行测定的不足。所用的过渡族金属离子过渡族金属离子就叫离子探针离子探针 离子探针的生物及化学依据离子探针的生物及化学依据 大多数的酶要靠金属离子表现其活性探针离子具有与原生物分子中的金属离子相同或相似的物理化学行为：如半径、化学配位性质、立体化学行为等，可以置换 原来这么简单啊！蛋白质三级结构三级结构血红素血红素肽链扭转肽链扭转血红蛋白的三级结构血红蛋白的三级结构非过渡金属离子（饱和电子层结构）过渡族金属离子（不饱和电子层结构）K+1 Zn+2 Mg+2 Ca+2Co+2 Tl+1 Mn+2 Gd+3 Eu+3 Tb+3离子半径/nm0.133 0.069 0.055 0.0990.072 0.140 0.088 0.0938 0.095 0.0923静电势/（Z2/r）0.75 4.80 5.12 3.78 4.88 0.67 4.40 表一表一：一些生物大分子中有关金属离子参数Mn+2取代苹果酸酶中的Mg+2后，该酶同样具有催化L-苹果酸脱羧地反应活性碳酸酐酶、羧酞酶及乳酸脱氢酶中含有Zn+2，用Co+3 代替Zn+2，这些酶仍具有活性伴刀豆球蛋白A含有Mn和Ca，用稀土离子 Eu+3,Tb+3,Gd+3置换Ca+2后，该蛋白仍然保持有结 合糖的活性 蛋白质及酶的荧光探针蛋白质及酶的荧光探针v蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。另外蛋白质含有氨基（NH2 或NH），SH，COOH和=CO,可用与以上基团发生反应的荧光 衍生试剂对蛋白质标记，进而用色谱及电泳分离紫外可见或荧光检测蛋白质 v蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙氨酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光特性会发生变化，从而可以研究蛋白质的结构和测定蛋白质。这其中有一种叫做免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术，即荧光抗体方法，就是把特异性抗原多 次注入动物体，使之产生抗体，将抗体球蛋白从血清中分离 出来，用荧光染料标记，制成荧光标记抗体溶液。免疫荧光 染色比其他的生物染色方法有较高的特异性和灵敏度。抗体（免疫球蛋白）与荧光染料结合后，仍不失抗体的免疫活性，称为荧光抗体。用于标记抗体的荧光染料于一般的荧光染料 不同，必须容易与抗体球蛋白结合，又不影响其免疫活性；还要求性能稳定、容易溶解和标记方法简单。由于蛋白质本 身也具有荧光，为了减少蛋白质本身的荧光干扰，标记抗体 的荧光染料不但荧光量子产率高，还要求荧光发射波长较长。常用的标记抗体的荧光染料有荧光素异硫氰酸酯、四甲基罗 丹明异硫氰酸酯和罗丹明B200等。核酸分子荧光探针及核酸染色核酸分子荧光探针及核酸染色 沿核酸的螺旋方向看，双螺旋表面有两个沟槽，一个宽槽和一个窄槽，这两个沟槽使碱基外露，为分子探针或其他分子与碱基作用提供了空间。窄槽窄槽 宽槽宽槽核酸染色剂及荧光探针的应用核酸染色剂及荧光探针的应用溶液中核酸的定量测定 单分子核酸检测 核酸的凝胶染色体电泳分离检测在荧光共振能量转移（FRET）技术中的应用 DNA序列分析DNA序列分析中的荧光染料序列分析中的荧光染料：在电泳分离荧光法检测DNA 序列分析中，通常分四组（A,C,G,T体系）进行，如果用 四种不同的荧光染料为探针,标记一个共同的引物，分别 用在 A、C、G、T四个反应体系中，等于用不同的探针 专一地标记了不同的碱基，利用各荧光探针光谱的差别 便可把不同的碱基区分开,因此选择一组四种合适的染料 成为关键，它们应满足以下条件它们应满足以下条件：(1)吸收和发射光谱应在可见光区，以降低散射和荧光背景；(2)各染料的荧光发射波长因该有明显不同，以便区分不同染料;(3)应有很强的荧光强度，以获得高灵敏度；(4)不严重干扰引物的杂交作用，使其不影响测序反应效率；(5)染料的存在不严重改变电泳谱图。n n表二表二表二表二：菲啶和菲啶和口口口口丫啶类嵌入剂及其丫啶类嵌入剂及其 与与DNADNA结合物的有关性能结合物的有关性能n 表三表三：含吲哚和苯并咪唑类嵌入剂及其 与DNA结合物的有关性能 n n核酸分子探针种类核酸分子探针种类：目前作为核酸分子探针的有机目前作为核酸分子探针的有机 分子染料有几十种，按探针分子结构可分为：分子染料有几十种，按探针分子结构可分为：菲啶和菲啶和口口口口丫啶类染料、吲哚和咪唑类染料、丫啶类染料、吲哚和咪唑类染料、碳菁阳离子染料、苯并呋喃酮（香豆素）类等。碳菁阳离子染料、苯并呋喃酮（香豆素）类等。n表四表四：TOTO-1系列染料及其 与DNA结合物的有关性能探针序号溶解性max/nm*103/（1mol-1*cm-1）(ex/em)/nm性能及应用溶剂1H2ODMSO518 5.2518/605不渗透膜；双股DNA嵌入剂；死细胞染色；染色体计数染色；电泳；流动细胞光度法；氩-离子激光甲醇2H2O，DMF 535 5.8 536/617不渗透膜；死细胞染色；染色体和细胞计数染色甲醇3DMSO 518 3.9 518/600渗透膜；染色核酸和真核生物及一些细菌的细胞质甲醇4DMF 500 53 500/526渗透膜；RNA/DNA的辨别测定；溶酶体标记；流动细胞光度法水或甲醇5DMSO 528 7.0 528/617不渗透膜；高亲合DNA标记；死细胞 染色；电泳prestain；氩-离子和He-Ne激光甲醇6H2O;DMF 421 11 431/498不渗透膜；AT选择；高亲合DNA标记甲醇探针序号溶解性max/nm*103/（1mol-1*cm-1）(ex/em)/nm性能及应用溶剂10H2O,DMF 352 40 352/461渗透膜；AT选择，小沟槽键合，选择键合dsDNA；活细胞染色；细胞周期研究；染色体和细胞计数染色 水或甲醇 11 H2O,DMF 350 45 350/461渗透膜；AT选择，小沟槽键合，活细胞染色；细胞周期研究；染色体和细胞计数染色水或甲醇 12H2O,DMF 358 21 358/461半渗透膜；AT选择，细胞周期研究；染色体和细胞计数染色；支原体检测水或甲醇 13 H2O,甲醇 358 20 358/461同上水或甲醇 14H2O,DMF 364 25 364/455AT选择，与色霉素一起用于染色体成譜带水或甲醇探针序号溶解性max/nm*103/（1mol-1*cm-1）(ex/em)/nm性能及应用溶剂15(POPO-1)DMSO43492434/456不渗透膜;高亲合DNA标记；死细胞 染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色水或甲醇16(BOBO-1)DMSO462114462/481不渗透膜;高亲合DNA标记；死细胞 染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色水或甲醇17(POPO-3)DMSO534146534/470不渗透膜;高亲合DNA标记；死细胞 染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色水或甲醇18(BOBO-3)DMSO570148570/604不渗透膜;高亲合DNA标记；死细胞 染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色水或甲醇19(TOTO-1)DMSO514117514/533不渗透膜;高亲合DNA标记；死细胞 染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色；可氩-离子激光发射器激发水或甲醇20(YOYO-1)DMSO49199491/509不渗透膜;超灵敏高亲合DNA标记；单一分子标记；死细胞染色；染色体和细胞计数染色；与甲基绿合成染色体城譜带；电泳前染色水或甲醇21(TOTO-3)DMSO642102642/660不渗透膜；高亲合DNA标记；死细胞染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色；长波长光谱水或甲醇22(YOYO-3)DMSO612167612/631不渗透膜；高亲合DNA标记；死细胞染色；染色体和细胞计数染色；电泳前染色；可橙色He-Ne-激光发射器激发水或甲醇
