2022年细胞迁移侵袭实验操作步骤_共页.docx
精选学习资料 - - - - - - - - - 迁移试验（ cell migration assay）试验介绍 细胞迁移与侵袭试验将 Transwell 小室放入培育板中,小室内称上室,培育板内称下室,上下层培育液以 聚碳酸酯膜 相隔,将讨论的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培育液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯 膜,就可以进行共培育、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的讨论；试验步骤：1 材料预备：可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8 m,没包被胶的 Coster 和 Corning 公司的也较常用,Transwell迁移试验的细胞培育板24 孔板；细胞培育板应当与购买的Transwell 小室相配套, BD 公司的 Matrigel ,无血清 DMEM ,1% 胎牛血清 DMEM 和 1640 培育基,DMEM 完全培育基, 1640 完全培育基（也可加到20% 血清）,无菌 PBS ,棉签,胰酶,4% 多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液（2 步骤和流程 2.1 基质胶铺板：0.1% （ g/ml ）PBS 结晶紫）用 BD 公司的 Matrigel 1：8（依据细胞产生mmp 的量来打算）稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置3730min 使 Matrigel 聚合成凝胶；使用前进行基底膜水化；2.2 制备细胞悬液制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 不是必需的；消化细胞,终止消化后离心弃去培育液,12 24h ,进一步去除血清的影响；但这一步并（用 PBS 洗 12 遍）,用含 BSA 的无血清培养基重悬；调整细胞密度至 5× 105/ml；2.3 接种细胞 取细胞悬液 100 l 加入 Transwell 小室；24 孔板下室一般加入 600 l 含 20%FBS 的培育基,特殊留意的是,下层培育液和小室 间常会有气泡产生,一旦产愤怒泡,下层培育液的趋化作用就减弱甚至消逝了,在种板的时候要特殊留心,一旦显现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培育板；培育细胞：常规培育1248h （主要依癌细胞侵袭才能而定）；24h 较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不行忽视；2.4 结果统计直接计数法, “贴壁 ”细胞计数,这里所谓的“贴壁 ”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞；取出 Transwell 小室,弃去孔中培育液,用无钙的PBS 洗 2 遍,甲醇固定30 分钟,将小室适当风干；0.1% 结晶紫染色20 min ,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS 洗 3 遍；400 倍显微镜下立即五个视野观看细胞,记数；试验材料本文档下载后依据实际情形可编辑修改使用名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - （1）Transwell chamber: 24-well, 8.0- m pore membranes Corning （2）细胞培育相关试剂：无血清培育基,10血清培育基, PBS,0.02 EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液： Giemsa染液（5）封片剂：中性树胶（6）其他：小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片操作步骤（1）全部细胞培育试剂和Transwell chamber 放在 37温育；（2）待测细胞培育至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培育基先后洗涤一次,用无血清培育基悬浮细胞,计数,调整浓度为 2× 105 /ml ；（3）在下室（即 24 孔板底部）加入 600800 l含 10血清的培育基,上室加入 100150 l 细胞悬液,连续在孵箱培育 24 小时；（4）用镊子当心取出 chamber,吸干上室液体,移到预先加入约 800 l 甲醇的孔中,室温固定 30 分钟；（5）取出 chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约 800 l Giemsa染液的孔中,室温染色 1530 分钟；（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒当心擦去上室底部膜表面上的细胞；（7）用小镊子当心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片；（8）显微镜下取 9 个随机视野计数,统计结果；留意事项（1）依据待测细胞体积大小挑选合适孔径的chamber；常用的为 8.0- m孔径（如 AGS细胞）,假如细胞体积较大可以考虑用 10- m孔径；（2）依据待测细胞的迁移才能强弱调整细胞数和迁移时间；常规 24-well chamber 接种细胞数约为 25× 104/well ,迁移时间 1236 小时；（3）由于 Corning 公司的 24-Transwell内含 12 个独立的 chamber,为了防止操作污染,每次试验可预先另预备一块 24 孔一般培育板（ Corning ）；（4）假如细胞迁移才能较弱,下室液体可用 的上清加 50 g/ml FN（Fibronectin3T3 细胞无血清培育 24 小时获得）,详细可查阅相关文献；（5）细胞悬液加入膜中心,尽量保证液面水平；（6）固定染色擦洗时动作当心,防止擦去膜底面的细胞；但肯定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞,以免影响读数；特殊是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要当心防止将膜戳破；本文档下载后依据实际情形可编辑修改使用名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - （7）Chamber和膜上都无法标记,操作时应当心防止混淆试验组和对比组；（8）充分晾干,防止残留水分导致镜下聚焦不一样；细胞侵袭试验（cell invasion assay）试验材料（1）Matrigel BD 5mg/ml,-20储存（2）其余材料同迁移试验操作步骤（1）Matrigel在 4过夜融解；Matrigel至终浓度 1mg/ml,冰上操作；（2）用 4预冷的无血清培育基稀释（3）在 chamber 上室底部中心垂直加入 45 小时使其干成胶状；（4）后续步骤同迁移试验（1-8 ）；留意事项100 l 稀释后的 Matrigel ,37温育（1）Matrigel 在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提前在 4预冷；（2）铺胶时保证液面水平,胶的厚度匀称一样,切勿产愤怒泡；（3）其他留意事项同迁移试验；其他Transwell 做肿瘤侵袭试验的详细步骤1 基质胶预备：将冻存于80 度冰箱的 BD matrigel 4 度过夜（ 24h ）,变成液态；（2）取 300ul 无血清培育基,加入 60ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ,混匀,（4操作,最好在冰浴上） ,加入上室各 100ul （3 个室）；放入 37培育箱中,孵育 4-5h（>5h ）；此间常常观看,当显现“白色层 ”时,说明已经变为固态；注释：无血清培育基和基质胶按1：5 稀释,每孔加50ul ,在 37培育箱中1-2h ；（3）消化细胞,无血清培育基洗3 次,计数,配成细胞悬液；（4）用无血清培育基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 细胞悬液；（5）下腔室中加入 500ul 含有 20FBS 条件培育基；（6）37培育箱中,孵育 20-24h ；（7）取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍, 5% 戊二醛固定, 4；（8）加入结晶紫（0.1% ）染色或 Giemsa 染色（ 510min ）,室温 0.5h , PBS 洗 2遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观看；迁移试验本文档下载后依据实际情形可编辑修改使用名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - transwell 在 24 孔板中浸泡1 小时；消化细胞,无血清培育基洗2 次,计数,配成细胞悬液,每孔加入 100ul 细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培育基或其他刺激因子； 37培育箱中,孵育 20-24h ；取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍, 5% 戊二醛固定,4； PBS 洗 2 遍,加入结晶紫（0.1% ）染色,室温 0.5h ,PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观看计数 10 照相,记录；侵袭试验取 300ul 无血清培育基,加入 30ul （或 50ug/ 每室）Matrigel ,混匀,（4 操作,最好在冰浴上） ,加入上室各 100ul （ 3 个室）； 放入 37 培育箱中,孵育 4-5h （ >5h ）； 消化细胞,无血清培育基洗 3 次,计数,配成 细胞悬液；用无血清培育基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 细胞悬液；下腔室中加入 600ul 无血清 条件培育基； 37 培育箱中,孵育 20-24h ；取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍,5% 戊二醛固定,4 ；PBS 洗 2 遍,加入结晶紫（0.1% ）染色,室温0.5h , PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观看transwell 小室是否可以重复利用,该怎样消毒用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水 3× 5min,蒸馏水 3× 5min,室温凉干,用前紫外线小室正面 3h,反面 6h,微波,低火10min× 2 ,成效很好；本文档下载后依据实际情形可编辑修改使用名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页
