最新实验一苏云金芽孢杆菌ICP基因的检测PPT课件.ppt

实验一苏云金芽孢杆菌实验一苏云金芽孢杆菌ICPICP基因的检测基因的检测实验四、实验四、T4噬菌体基因组噬菌体基因组rII 区域不同基因突变的互补区域不同基因突变的互补 四实验方法和内容四实验方法和内容（一）噬菌体T4裂解液的制备 1 1双层平板法制备裂解液双层平板法制备裂解液双层平板法制备裂解液双层平板法制备裂解液（1 1）将）将）将）将E.coliCE.coliC接种接种接种接种3mLHB3mLHB中，中，中，中，3737 震荡培养震荡培养震荡培养震荡培养5656小时。小时。小时。小时。（2 2）制备）制备）制备）制备HAHA平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置5050 烘烘烘烘3030分钟备用。分钟备用。分钟备用。分钟备用。（3 3）取小试管一只，加）取小试管一只，加）取小试管一只，加）取小试管一只，加0.5mL0.5mL菌悬液，加菌悬液，加菌悬液，加菌悬液，加0.2mL0.2mL浓度为浓度为浓度为浓度为105105106106的的的的T4T4储存液，再加入储存液，再加入储存液，再加入储存液，再加入3mL503mL50 左右的左右的左右的左右的HSAHSA（软琼脂培养（软琼脂培养（软琼脂培养（软琼脂培养基），混合均匀后倒在基），混合均匀后倒在基），混合均匀后倒在基），混合均匀后倒在HAHA平板上层，凝固后平板上层，凝固后平板上层，凝固后平板上层，凝固后3737培养过夜。培养过夜。培养过夜。培养过夜。（4 4）用涂棒）用涂棒）用涂棒）用涂棒 将将将将HAHA平板上层软琼脂刮入离心管，加入平板上层软琼脂刮入离心管，加入平板上层软琼脂刮入离心管，加入平板上层软琼脂刮入离心管，加入3mLHB3mLHB，静置，静置，静置，静置3030分钟，加分钟，加分钟，加分钟，加2323滴氯仿，剧烈震荡半分钟。滴氯仿，剧烈震荡半分钟。滴氯仿，剧烈震荡半分钟。滴氯仿，剧烈震荡半分钟。（5 5）4000rpm4000rpm离心离心离心离心15min15min，取出上清液，加几滴氯仿，取出上清液，加几滴氯仿，取出上清液，加几滴氯仿，取出上清液，加几滴氯仿，4 4冰箱保存备用。冰箱保存备用。冰箱保存备用。冰箱保存备用。（一）噬菌体T4裂解液的制备2液体法制备裂解液液体法制备裂解液（1）将）将E.coliC接种接种3mLHB中，中，37震荡培养震荡培养23小时。小时。（2）加入）加入1%体积的体积的T4储存液（或单噬储存液（或单噬斑斑1个），继续震荡培养个），继续震荡培养5小时，一般应测小时，一般应测OD600值，当值，当OD值下降又回升时停止培值下降又回升时停止培养。养。（3）加）加23滴氯仿，震荡半分钟，滴氯仿，震荡半分钟，4000rpm离心离心15分钟，取上清液加几滴氯分钟，取上清液加几滴氯仿，置仿，置4冰箱保存备用。冰箱保存备用。（二）裂解液效价测定将将将将E.coliCE.coliC接种接种接种接种3mLHB3mLHB中，中，中，中，3737震荡培养震荡培养震荡培养震荡培养5 5小时。小时。小时。小时。制备制备制备制备HAHA平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置平板，待凝固后置5050 烘烘烘烘3030分钟备用。分钟备用。分钟备用。分钟备用。将将将将T4T4裂解液依次稀释至裂解液依次稀释至裂解液依次稀释至裂解液依次稀释至10-710-7。取一只小试管，加入取一只小试管，加入取一只小试管，加入取一只小试管，加入0.2mLE.coliC0.2mLE.coliC，加入，加入，加入，加入T4T4裂解裂解裂解裂解液液液液0.1mL0.1mL（10-610-6，10-710-7），每个稀释度两只试管，），每个稀释度两只试管，），每个稀释度两只试管，），每个稀释度两只试管，再加入再加入再加入再加入2.5mLHAS2.5mLHAS（5050左右），左右），左右），左右），混合均匀后迅混合均匀后迅混合均匀后迅混合均匀后迅速倒在速倒在速倒在速倒在HAHA平板上层，凝固后，平板上层，凝固后，平板上层，凝固后，平板上层，凝固后，3737倒置培养。倒置培养。倒置培养。倒置培养。培养培养培养培养6 6小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效价。价。价。价。检测回复突变，取一只小试管，加入检测回复突变，取一只小试管，加入检测回复突变，取一只小试管，加入检测回复突变，取一只小试管，加入0.2mLE.coli0.2mLE.coliK K，加入，加入，加入，加入T4T4裂解液裂解液裂解液裂解液0.1mL0.1mL（10-510-5），再加入），再加入），再加入），再加入2.5mL2.5mLHASHAS（5050左右），左右），左右），左右），混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在混合均匀后迅速倒在HAHA平板平板平板平板上层，凝固后，上层，凝固后，上层，凝固后，上层，凝固后，3737倒置培养。倒置培养。倒置培养。倒置培养。（三）互补实验（三）互补实验1）取取E.coli K，接种于，接种于HB培养基，培养基，37oC，180rpm振荡培养过夜。振荡培养过夜。2）首先制备好）首先制备好4块块HA平板，将装有平板，将装有HSA（软琼脂）的试管置于（软琼脂）的试管置于48oC水浴保温。水浴保温。3）在每一）在每一HA平板的底部预先标记好以下内平板的底部预先标记好以下内容：容：Nophage,26X,28X,29X （三）互补实验（三）互补实验4 4）在每支）在每支）在每支）在每支HSAHSA试管中加试管中加试管中加试管中加0.2ml0.2mlE.coli KE.coli K过夜培养物。过夜培养物。过夜培养物。过夜培养物。5 5）将第一支）将第一支）将第一支）将第一支HSAHSA试管倒到试管倒到试管倒到试管倒到“无噬菌体无噬菌体无噬菌体无噬菌体”的平板上，用做的平板上，用做的平板上，用做的平板上，用做回复突变的对照。回复突变的对照。回复突变的对照。回复突变的对照。6 6）往第二支）往第二支）往第二支）往第二支HSAHSA试管中加试管中加试管中加试管中加0.1mlrII26(1x109/mL),0.1mlrII26(1x109/mL),混混混混合好后倒合好后倒合好后倒合好后倒“26x”“26x”平板，其它的噬菌体均以相同的方平板，其它的噬菌体均以相同的方平板，其它的噬菌体均以相同的方平板，其它的噬菌体均以相同的方式倒好平板。式倒好平板。式倒好平板。式倒好平板。7 7）将噬菌体）将噬菌体）将噬菌体）将噬菌体2626，2828，2929分别进行分别进行分别进行分别进行1010倍稀释。倍稀释。倍稀释。倍稀释。8 8）用接种环或用移液器吸取）用接种环或用移液器吸取）用接种环或用移液器吸取）用接种环或用移液器吸取3-53-5 l l各种稀释后的噬菌各种稀释后的噬菌各种稀释后的噬菌各种稀释后的噬菌体悬液（体悬液（体悬液（体悬液（1x108/ml1x108/ml），小心点到每一平板相应的），小心点到每一平板相应的），小心点到每一平板相应的），小心点到每一平板相应的位置上。位置上。位置上。位置上。实验注意事项：实验注意事项：点样时应小心勿将琼脂划破！点样时应小心勿将琼脂划破！各种噬菌体的点样位点必须有一各种噬菌体的点样位点必须有一定间隔，防止连成片不易分析结定间隔，防止连成片不易分析结果！果！点完样后不要立即翻动平板，待点完样后不要立即翻动平板，待所点样品完全干后，再倒置平板所点样品完全干后，再倒置平板培养！培养！五实验报告五实验报告：（一）实验结果用+或表示，如点样位置上有较多的噬菌斑则为 ，无噬菌斑则为 ，但要与对照平板比较，检查每一 rII突变型单独感染K菌株是否形成噬菌斑，记录下观察的实验结果。（二）分析各T4噬菌体基因组rII突变型的基因互补关系，依据实验结果确定噬菌体26、28分别为哪一基因突变。六思考题六思考题1）互补实验的意义。）互补实验的意义。2）两个不同基因突变的）两个不同基因突变的T4噬菌噬菌体所发生的互补是基因产物体所发生的互补是基因产物的互补，为什么发生互补后的互补，为什么发生互补后会形成野生型的会形成野生型的T4噬菌体？噬菌体？结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！17