最新实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定PPT课件.ppt

实验实验4 4叶绿素的提取、理化性叶绿素的提取、理化性质和含量测定质和含量测定实验四实验四 叶绿素的提取、理化性质叶绿素的提取、理化性质和含量测定和含量测定（p130136）一、叶绿素的提取一、叶绿素的提取二、叶绿素的理化性质二、叶绿素的理化性质三、叶绿素含量的测定三、叶绿素含量的测定分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。2.2.3 2.2.3 含量测定含量测定含量测定含量测定叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰最大吸收峰分别位于663nm和645nm；叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸收系数相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。故叶绿素浓度COD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重2.3 叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质2.3.1 叶绿素的结构叶绿素的结构2.3.2 取代反应取代反应2.3.3 皂化反应皂化反应2.3.1 2.3.1 叶绿素叶绿素叶绿素叶绿素的结构的结构的结构的结构叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。2.3.2 2.3.2 取代反应取代反应取代反应取代反应2.3.2.1 稀酸稀酸去镁去镁铜代铜代2.3.2.2 浓酸浓酸去镁去镁水解水解卟啉环中的卟啉环中的MgMg处于不稳定的状态，可被处于不稳定的状态，可被H H+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+等离子取代。等离子取代。2.3.2.1 稀酸稀酸叶绿素溶液与稀酸叶绿素溶液与稀酸(如如:草酸草酸)作用，作用，H+取代取代Mg后的产物后的产物为褐色的去镁叶绿素；为褐色的去镁叶绿素；去镁叶绿素与去镁叶绿素与Cu2+或或Zn2+作用，作用，Cu2+等离子取代后等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；的产物为深绿色的铜代叶绿素等；2.3.2.2 浓酸浓酸叶绿素溶液与浓酸叶绿素溶液与浓酸(如如:盐酸盐酸)作用，除了代换作用，除了代换Mg外，可外，可使去镁叶绿素迅速使去镁叶绿素迅速分解分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。镁叶绿酸。叶绿素叶绿素去镁叶绿素去镁叶绿素铜代铜代叶绿素叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）2.3.3 2.3.3 皂化反应皂化反应皂化反应皂化反应叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化甲醇酯化，另一个被，另一个被叶绿醇酯化叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。皂化分层皂化分层叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，于稀酒精溶液中，不能进入苯层不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中一部分苯分散在水中形成一部分苯分散在水中形成乳胶体乳胶体，出现一层乳，出现一层乳白色的溶液白色的溶液低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。3 材料、试剂与配备材料、试剂与配备1 1 材料材料 菠菜叶片菠菜叶片2 2 仪器设备仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)(25ml,50ml)，分光光度，分光光度计，水浴锅等计，水浴锅等3 3 试剂试剂 95%95%乙醇，苯，浓盐酸，乙醇，苯，浓盐酸，36%36%乙酸，乙酸，CuSO CuSO4 4，MgCOMgCO3 3，石英砂石英砂4 实验步骤实验步骤4.1 叶绿素的提取叶绿素的提取4.2 叶绿素的物理性质叶绿素的物理性质透射光颜色透射光颜色反射光颜色反射光颜色4.3 叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定4.4 叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质取代反应取代反应皂化反应皂化反应4.1叶绿素的提取叶绿素的提取1.新鲜菠菜叶片，新鲜菠菜叶片，去掉中脉去掉中脉后的样品称重后的样品称重(约约2-3g,记录样品重量记录样品重量)；2.剪碎入研钵中，加少量石英砂和剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉碳酸镁粉及及2-3 ml的的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；3.过滤到过滤到25 ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（直至滤直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至定容至25ml(后称原液后称原液)，摇匀。，摇匀。4.2 叶绿素的荧光叶绿素的荧光取取3 ml叶绿素提取叶绿素提取原液原液，观察其透射光、反射光，观察其透射光、反射光下的颜色；下的颜色；4.3叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定取取5 ml叶绿素提取原液移入至叶绿素提取原液移入至50 ml容量瓶，容量瓶，95%乙醇定容乙醇定容(稀释液稀释液)以以95%乙醇作为空白对照，测乙醇作为空白对照，测OD652叶绿素浓度叶绿素浓度:COD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度叶绿素的浓度提取液提取液体积体积稀释倍数稀释倍数/样品鲜重样品鲜重4.4 叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质4.4.1 取代反应取代反应4.4.1.1 稀酸：稀酸：取取3 ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸叶绿素原液，一滴滴加入醋酸(先快后慢先快后慢)，观察，观察并记录颜色变化；并记录颜色变化；向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量CuAc颗颗粒，粒，65水浴加热，观察并记录其颜色变化。水浴加热，观察并记录其颜色变化。4.4.1.2 浓酸浓酸取取3 ml叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并记录颜色变化。记录颜色变化。4.4.2 皂化反应皂化反应取取3 ml叶绿素提取原液，加叶绿素提取原液，加1 ml 20%NaOH-甲醇溶液，甲醇溶液，摇匀，摇匀，65水浴水浴5 min；取出冷却后，先加取出冷却后，先加3 ml苯，后加苯，后加3 ml水（沿壁慢慢加入），水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。轻轻摇匀，静置观察其分层现象。5 结果记录与数据处理结果记录与数据处理 颜色变化颜色变化/分层分层 原原 理理荧光现象荧光现象取代反应取代反应醋酸醋酸 CuAc 浓浓HCl皂化反应皂化反应上层上层 中层中层 下层下层表表表表1 1 叶绿素的理化性质叶绿素的理化性质叶绿素的理化性质叶绿素的理化性质5.1 实验现象记录与分析实验现象记录与分析5.2 叶绿素含量计算与分析叶绿素含量计算与分析叶绿素浓度叶绿素浓度:COD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度叶绿素的浓度提取提取液体积液体积稀释倍数稀释倍数/样品鲜重样品鲜重以样品重为3g为例:=C（2550/5）/3=OD652/（34.53）（2550/5）6 注意事项注意事项操作应在弱光下进行操作应在弱光下进行？研磨时间尽可能短，以不超过研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜分钟为宜分光光度计的正确使用分光光度计的正确使用(更换波长后要调更换波长后要调0)皂化反应最后做皂化反应最后做 在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在可激烈摇匀，放在3040的水浴中加热，溶的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。7 思考题1 提取叶绿素时为何要加入提取叶绿素时为何要加入MgCO3？2 为何选用为何选用652 nm 测叶绿素的含量？测叶绿素的含量？3 解释皂化反应的分层现象解释皂化反应的分层现象实验五实验五 硝酸还原酶活性的测定（硝酸还原酶活性的测定（p124127）