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国家自然科学基金申请讲座医教部苏景宽二四年二月 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望第第一一部分部分 如何撰写申请书如何撰写申请书一、摘一、摘 要（限要（限400400字）字）包括：包括：研究方法、内容、目标、科学意义等研究方法、内容、目标、科学意义等 如：如：“用用方法（手段）进行方法（手段）进行研究，探索研究，探索/证证明明问题，对阐明问题，对阐明机制机制 揭示揭示规律有重要意规律有重要意义，为义，为奠定基础提供奠定基础提供思路思路”采用改良的消减杂交技术采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障建立老年性白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基通过基因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞观察细胞的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化，研究基因的功能。变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为为防治白内障提供新思路和理论依据。防治白内障提供新思路和理论依据。二、立论依据二、立论依据对对基基础础研研究究，着着重重结结合合国国际际科科学学发发展展趋趋势势，论论述述项目科学意义项目科学意义 对对应应用用基基础础研研究究，着着重重结结合合学学科科前前沿沿，围围绕绕国国民民经经济济和和社社会会发发展展中中的的重重要要科科技技问问题题论论述述其其应应用用前景前景在研究领域（疾病诊防治）层面在研究领域（疾病诊防治）层面从研究方向展开从研究方向展开围绕本项目拟解决的问题围绕本项目拟解决的问题进行归纳分析进行归纳分析提出设想提出设想从研究领域从研究领域（疾病（疾病诊诊防治）防治）切入切入研究意义研究意义立论依据立论依据 1 1、项目的研究意义、项目的研究意义 撰写方法：撰写方法：从疾病入手，简述其特点、危害，从疾病入手，简述其特点、危害，目前主要的治疗方法及其存在的问题。目前主要的治疗方法及其存在的问题。简要分析该病发病机理和主要研究热点，引简要分析该病发病机理和主要研究热点，引 出目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的出目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的 问题，以此为切入点提出假设，阐述如果实现预问题，以此为切入点提出假设，阐述如果实现预 期目标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有期目标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有 的理论意义和临床价值。的理论意义和临床价值。老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增 加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类 第一位的致盲疾病。第一位的致盲疾病。第一位的致盲疾病。第一位的致盲疾病。迄今为止迄今为止迄今为止迄今为止,治疗白内障唯一有效的治疗白内障唯一有效的治疗白内障唯一有效的治疗白内障唯一有效的 方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的 术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障 所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重 的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的 发病时间延缓发病时间延缓发病时间延缓发病时间延缓10101010年，白内障手术的数量就会减少年，白内障手术的数量就会减少年，白内障手术的数量就会减少年，白内障手术的数量就会减少45%45%45%45%1111。所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展 的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济 问题问题问题问题2222。但是目前我们对老年性白内障发病机理的认但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能抓住引起白内障发生、发展的主要环节。抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此，据此，本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。理论依据。2 2、国内外现状分析（综述）、国内外现状分析（综述）存在问题：存在问题：存在问题：存在问题：文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决提出的问题别人已解决提出的问题别人已解决提出的问题别人已解决-低水平重复低水平重复低水平重复低水平重复。对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用，缺乏实际应用的可行性缺乏实际应用的可行性缺乏实际应用的可行性缺乏实际应用的可行性-无法实现预期目标无法实现预期目标无法实现预期目标无法实现预期目标。-已有方法与掌握方法的人的结合；已有方法与掌握方法的人的结合；已有方法与掌握方法的人的结合；已有方法与掌握方法的人的结合；-方法理论上可行与现实可行性的结合。方法理论上可行与现实可行性的结合。方法理论上可行与现实可行性的结合。方法理论上可行与现实可行性的结合。对国内外现状缺乏归纳分析，只是简单罗列，对国内外现状缺乏归纳分析，只是简单罗列，对国内外现状缺乏归纳分析，只是简单罗列，对国内外现状缺乏归纳分析，只是简单罗列，缺乏逻辑性和针对性缺乏逻辑性和针对性缺乏逻辑性和针对性缺乏逻辑性和针对性-总结与表达不够总结与表达不够总结与表达不够总结与表达不够。撰写方法：要撰写方法：要撰写方法：要撰写方法：要紧紧围绕紧紧围绕紧紧围绕紧紧围绕本次申请项目的主题。本次申请项目的主题。本次申请项目的主题。本次申请项目的主题。1 1 1 1、从疾病切入，、从疾病切入，、从疾病切入，、从疾病切入，简要论述简要论述简要论述简要论述国内外研究成果，并引国内外研究成果，并引国内外研究成果，并引国内外研究成果，并引 出当前的热点研究方向。出当前的热点研究方向。出当前的热点研究方向。出当前的热点研究方向。2 2 2 2、从研究方向展开，、从研究方向展开，、从研究方向展开，、从研究方向展开，较详细地分析较详细地分析较详细地分析较详细地分析国内外的研究国内外的研究国内外的研究国内外的研究 进展，阐明在疾病发病机理或诊断、治疗研究进展，阐明在疾病发病机理或诊断、治疗研究进展，阐明在疾病发病机理或诊断、治疗研究进展，阐明在疾病发病机理或诊断、治疗研究 中中中中存在的问题存在的问题存在的问题存在的问题。3 3 3 3、围绕、围绕、围绕、围绕存在的问题存在的问题存在的问题存在的问题，结合国内外以往的研究结果、，结合国内外以往的研究结果、，结合国内外以往的研究结果、，结合国内外以往的研究结果、当前的现状及今后的发展趋势，当前的现状及今后的发展趋势，当前的现状及今后的发展趋势，当前的现状及今后的发展趋势，详细论述和分详细论述和分详细论述和分详细论述和分 析析析析这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己 申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。4 4 4 4、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究的依据。的依据。的依据。的依据。新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究的理论依据和实验依据。的理论依据和实验依据。的理论依据和实验依据。的理论依据和实验依据。要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。楚，绝不能是一种简单的移植。楚，绝不能是一种简单的移植。楚，绝不能是一种简单的移植。例如：单链抗体例如：单链抗体例如：单链抗体例如：单链抗体+功能基团，理论上可以实现融合，功能基团，理论上可以实现融合，功能基团，理论上可以实现融合，功能基团，理论上可以实现融合，但存在但存在但存在但存在“活性、表达载体选择、纯化问题。活性、表达载体选择、纯化问题。活性、表达载体选择、纯化问题。活性、表达载体选择、纯化问题。5 5 5 5、提出本项目的研究设想。、提出本项目的研究设想。、提出本项目的研究设想。、提出本项目的研究设想。防治白内障必须针对其发病的主要环节。多防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的发生机理。发生机理。就致病的环境因素讲，就致病的环境因素讲，氧化因子、紫氧化因子、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障的发生有关。的发生有关。就研究的部位分，就研究的部位分，晶状体中皮质与晶状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体晶状体上皮细胞上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。在白内障的形成中的变化更引人关注。因为因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、数量相对稳定的细胞，活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出它们分裂、分化出晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如此，的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单纯老化的晶状体之间存在差异纯老化的晶状体之间存在差异3-53-5 。体外实验也证实体外实验也证实体外实验也证实体外实验也证实多种因素多种因素多种因素多种因素(H2O2(H2O2(H2O2(H2O2、UV-BUV-BUV-BUV-B、晶、晶、晶、晶 状体蛋白的自身抗体状体蛋白的自身抗体状体蛋白的自身抗体状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中诱发的白内障模型中诱发的白内障模型中诱发的白内障模型中晶状体晶状体晶状体晶状体 上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节6-86-8。因此，因此，因此，因此，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶 状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所 在，也是有待我们深入研究的问题在，也是有待我们深入研究的问题在，也是有待我们深入研究的问题在，也是有待我们深入研究的问题。白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要以下三方面：白内障相关基因的研究主要以下三方面：一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的研究。细胞的研究。UV-BUV-B辐射作用诱导的白内障中晶辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是主要的靶细胞，其状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATPNa-K-ATP酶酶的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞的凋亡增加，其中有胞的凋亡增加，其中有c-fosc-fos基因的表达增加；基因的表达增加；还有组蛋白还有组蛋白H4H4、H3 H3 的低表达的低表达 和蛋白酶和蛋白酶C C、-肌动蛋白、肌动蛋白、-肌动蛋白基因的高表达肌动蛋白基因的高表达9-129-12。CarperCarper等等1313利用利用RT-PCR-DD(reverse RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction transcription-polymerase chain reaction differential display)differential display)技术研究技术研究H2O2H2O2诱导的晶体诱导的晶体上皮细胞的基因差异性表达结果显示上皮细胞的基因差异性表达结果显示NADHNADH脱氢脱氢酶酶4 4亚基、细胞色素亚基、细胞色素b b、谷氨酰胺转移酶基因表、谷氨酰胺转移酶基因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 2（alternative splicing factoralternative splicing factor）、）、-三羟基异三羟基异丁酰辅酶丁酰辅酶A A水解酶基因表达的增加。水解酶基因表达的增加。二是利用转基因动物的研究。二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白波形纤维蛋白基因（基因（vimentinvimentin）、杂交的）、杂交的型中间纤维蛋白型中间纤维蛋白基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受抑制特点是晶状体纤维细胞分化受抑制14,1514,15。GongGong等等1616报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白33（3 Connexin3 Connexin）基因敲除小鼠（）基因敲除小鼠（knockout knockout mousemouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关早期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关的核性白内障。虽然体外实验和白内障转基因小的核性白内障。虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有关，目前尚缺乏进一步的报告。关，目前尚缺乏进一步的报告。三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee17Lee17利用利用RT-PCRRT-PCR技术研究显示前极性白内技术研究显示前极性白内障与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、障与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I I型型胶原纤维、胶原纤维、-平滑肌蛋白、平滑肌蛋白、TGF-1TGF-1、TGF-2TGF-2、TGF-TGF-型受体、结缔组织生长因子的基因表达型受体、结缔组织生长因子的基因表达有差异。有差异。KantorowKantorow等等1818利用利用RT-PCR-DDRT-PCR-DD研研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和因和1212个低表达的基因。但就个低表达的基因。但就DD-PCRDD-PCR技术来技术来讲，在实验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆讲，在实验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆全长全长cDNAcDNA的问题。的问题。上述三方面的研究均取得了不同程度的研究上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。明与白内障相关的基因及其功能。寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。的发病机理。寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术（subtractive hybridization,SHsubtractive hybridization,SHsubtractive hybridization,SHsubtractive hybridization,SH），它是），它是），它是），它是，但，但，但，但是实验操作复杂。是实验操作复杂。是实验操作复杂。是实验操作复杂。经过改进后的抑制性消减杂交经过改进后的抑制性消减杂交经过改进后的抑制性消减杂交经过改进后的抑制性消减杂交（suppression suppression suppression suppression subtractive hybridization,SSHsubtractive hybridization,SSHsubtractive hybridization,SSHsubtractive hybridization,SSH是是是是DiatchenkoDiatchenkoDiatchenkoDiatchenko等等等等1996199619961996年建立的方法）年建立的方法）年建立的方法）年建立的方法）简化了实验操作，但仍然问简化了实验操作，但仍然问简化了实验操作，但仍然问简化了实验操作，但仍然问题很多。题很多。题很多。题很多。我校生化教研室我校生化教研室我校生化教研室我校生化教研室建立了改良消减杂交技术建立了改良消减杂交技术建立了改良消减杂交技术建立了改良消减杂交技术19191919，20202020，其特点是：其特点是：其特点是：其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表简便易行，能够获得目的细胞特异表简便易行，能够获得目的细胞特异表简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5 5个为新基个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长异表达的基因，并克隆到全长cDNAcDNA，为进一步，为进一步的结构和功能研究打下基础。的结构和功能研究打下基础。基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNADNADNADNA分子变得更快捷、准确、高效。分子变得更快捷、准确、高效。分子变得更快捷、准确、高效。分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在基因芯片是在基因芯片是在基因芯片是在1996199619961996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNADNADNADNA探针集中到探针集中到探针集中到探针集中到1 1 1 1厘米见方的基片上，利用碱基互补原厘米见方的基片上，利用碱基互补原厘米见方的基片上，利用碱基互补原厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，理，理，理，DNADNADNADNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知探针中的已知碱基序列与被测定的未知探针中的已知碱基序列与被测定的未知探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNADNADNADNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，析杂交结果，析杂交结果，析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分从而对检测基因进行定性、定量和结构分从而对检测基因进行定性、定量和结构分从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知析，确定未知析，确定未知析，确定未知DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯 片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达 的所有基因建立的所有基因建立的所有基因建立的所有基因建立cDNAcDNAcDNAcDNA文库，再利用基因芯片技术文库，再利用基因芯片技术文库，再利用基因芯片技术文库，再利用基因芯片技术 制备成基因芯片制备成基因芯片制备成基因芯片制备成基因芯片，以此，以此，以此，以此检测多个样本中白内障晶状检测多个样本中白内障晶状检测多个样本中白内障晶状检测多个样本中白内障晶状 体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基 因，因，因，因，从中从中从中从中进一步筛选出白内障特异的基因进一步筛选出白内障特异的基因进一步筛选出白内障特异的基因进一步筛选出白内障特异的基因，它们中，它们中，它们中，它们中 可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两 种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地 得到白内障相关基因。得到白内障相关基因。得到白内障相关基因。得到白内障相关基因。综上所述，分子生物学技术的发展为研究白综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。3 3 3 3、参考文献、参考文献、参考文献、参考文献 A A A A、要以英文文献为主，同时也要引用国内同行、要以英文文献为主，同时也要引用国内同行、要以英文文献为主，同时也要引用国内同行、要以英文文献为主，同时也要引用国内同行 知名专家的文献。知名专家的文献。知名专家的文献。知名专家的文献。B B B B、引言信息要全：文章题目、作者姓名、具体、引言信息要全：文章题目、作者姓名、具体、引言信息要全：文章题目、作者姓名、具体、引言信息要全：文章题目、作者姓名、具体 出处（包括期刊名、年份、卷期、页码等）。出处（包括期刊名、年份、卷期、页码等）。出处（包括期刊名、年份、卷期、页码等）。出处（包括期刊名、年份、卷期、页码等）。C C C C、主要引用近五年的文献，最好能有、主要引用近五年的文献，最好能有、主要引用近五年的文献，最好能有、主要引用近五年的文献，最好能有04040404年的最年的最年的最年的最 新文献。新文献。新文献。新文献。三、研究方案三、研究方案 1 1、研究目标、研究目标 撰写要求：撰写要求：撰写要求：撰写要求：有限目标，与研究内容相呼应有限目标，与研究内容相呼应有限目标，与研究内容相呼应有限目标，与研究内容相呼应 如：探索如：探索如：探索如：探索问题，明确问题，明确问题，明确问题，明确关系，揭示关系，揭示关系，揭示关系，揭示规律，规律，规律，规律，阐明阐明阐明阐明原理（机制），建立原理（机制），建立原理（机制），建立原理（机制），建立方法等方法等方法等方法等 研究目标研究目标：筛选出与老年性白内障相关的基因，明确筛选出与老年性白内障相关的基因，明确 部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上 皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治 白内障提供线索。白内障提供线索。2 2、研究内容：、研究内容：存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；内容分散，不能集中阐明研究目标。内容分散，不能集中阐明研究目标。内容分散，不能集中阐明研究目标。内容分散，不能集中阐明研究目标。撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；与目标相辅相成，为研究目标服务。与目标相辅相成，为研究目标服务。与目标相辅相成，为研究目标服务。与目标相辅相成，为研究目标服务。篇幅要适度，注意与技术路线区别。篇幅要适度，注意与技术路线区别。篇幅要适度，注意与技术路线区别。篇幅要适度，注意与技术路线区别。研究内容研究内容研究内容研究内容：（1 1 1 1）筛选白内障相关基因：）筛选白内障相关基因：）筛选白内障相关基因：）筛选白内障相关基因：采用改良的消减采用改良的消减采用改良的消减采用改良的消减 杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞 和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立 cDNA cDNA cDNA cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用 基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上 皮细胞中筛选出白内障相关基因。皮细胞中筛选出白内障相关基因。皮细胞中筛选出白内障相关基因。皮细胞中筛选出白内障相关基因。（2 2 2 2）研究白内障相关基因的结构）研究白内障相关基因的结构）研究白内障相关基因的结构）研究白内障相关基因的结构：对白内障：对白内障：对白内障：对白内障 相关基因相关基因相关基因相关基因cDNAcDNAcDNAcDNA进行特异扩增、进行特异扩增、进行特异扩增、进行特异扩增、PCRPCRPCRPCR产物的克隆、产物的克隆、产物的克隆、产物的克隆、鉴定，测定基因序列，分析基因的结构，获得全长鉴定，测定基因序列，分析基因的结构，获得全长鉴定，测定基因序列，分析基因的结构，获得全长鉴定，测定基因序列，分析基因的结构，获得全长 基因。基因。基因。基因。（3 3 3 3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞 变化中的作用变化中的作用变化中的作用变化中的作用：利用反转录病毒，对培养的人晶状：利用反转录病毒，对培养的人晶状：利用反转录病毒，对培养的人晶状：利用反转录病毒，对培养的人晶状 体上皮细胞和在体小鼠晶状体进行基因转染，观察体上皮细胞和在体小鼠晶状体进行基因转染，观察体上皮细胞和在体小鼠晶状体进行基因转染，观察体上皮细胞和在体小鼠晶状体进行基因转染，观察 白内障相关基因对晶状体上皮细胞的影响以及在白白内障相关基因对晶状体上皮细胞的影响以及在白白内障相关基因对晶状体上皮细胞的影响以及在白白内障相关基因对晶状体上皮细胞的影响以及在白 内障形成中的作用。内障形成中的作用。内障形成中的作用。内障形成中的作用。观察指标如下：观察指标如下：观察指标如下：观察指标如下：存活细胞数存活细胞数存活细胞数存活细胞数；光镜、透射光镜、透射光镜、透射光镜、透射 电镜下细胞形态的变化电镜下细胞形态的变化电镜下细胞形态的变化电镜下细胞形态的变化；细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测：用原位：用原位：用原位：用原位 末端标记和连接酶介导末端标记和连接酶介导末端标记和连接酶介导末端标记和连接酶介导PCRPCRPCRPCR方法，从形态和方法，从形态和方法，从形态和方法，从形态和DNADNADNADNA 水平分析细胞凋亡；水平分析细胞凋亡；水平分析细胞凋亡；水平分析细胞凋亡；细胞增殖的检测细胞增殖的检测细胞增殖的检测细胞增殖的检测：用免疫组：用免疫组：用免疫组：用免疫组 织化学的方法检测核蛋白织化学的方法检测核蛋白织化学的方法检测核蛋白织化学的方法检测核蛋白Ki-67Ki-67Ki-67Ki-67；细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白 （VimentinVimentinVimentinVimentin、ActinActinActinActin）的检测）的检测）的检测）的检测：用：用：用：用NorthernNorthernNorthernNorthern杂交杂交杂交杂交 法检测法检测法检测法检测vimentin vimentin vimentin vimentin、actin mRNAactin mRNAactin mRNAactin mRNA的表达，用的表达，用的表达，用的表达，用SDS-SDS-SDS-SDS-PAGE PAGE PAGE PAGE及及及及Western blotWestern blotWestern blotWestern blot方法检测波形纤维蛋白、肌方法检测波形纤维蛋白、肌方法检测波形纤维蛋白、肌方法检测波形纤维蛋白、肌 动蛋白（均为尿素溶性蛋白）；动蛋白（均为尿素溶性蛋白）；动蛋白（均为尿素溶性蛋白）；动蛋白（均为尿素溶性蛋白）；晶状体蛋白的检晶状体蛋白的检晶状体蛋白的检晶状体蛋白的检 测测测测：用：用：用：用SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE方法观察水溶性蛋白方法观察水溶性蛋白方法观察水溶性蛋白方法观察水溶性蛋白 、晶状体蛋白的变化。晶状体