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微生物基本操作讲义微生物基本操作讲义主要内容：主要内容：1清洗、消毒和灭菌清洗、消毒和灭菌 2显微操作显微操作 3制片和染色制片和染色 4培养基的制备培养基的制备 5接种、分离纯化和菌种保存接种、分离纯化和菌种保存 6微生物常规鉴定技术微生物常规鉴定技术l3.3.间歇灭菌法间歇灭菌法（fractional sterilizationfractional sterilization）:将待灭菌的物将待灭菌的物品品100 100 加热加热15153030分分 钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于品置于3737温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸 汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。l4.4.高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽高压蒸汽 灭菌器内进行的。通常灭菌器内进行的。通常 在在1.05kg/cm21.05kg/cm2的压力下，温度达的压力下，温度达121.3,121.3,维持维持15153030分钟，可杀死分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于耐高温和不怕潮此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌。湿物品的灭菌。2.2.紫外线与射线灭菌法紫外线与射线灭菌法uu1.1.1.1.紫外线：紫外线：紫外线：紫外线：紫外线波长为紫外线波长为紫外线波长为紫外线波长为240240240240280nm280nm280nm280nm时具有杀菌作时具有杀菌作时具有杀菌作时具有杀菌作用，其中用，其中用，其中用，其中 以以以以260nm260nm260nm260nm最强。紫外线杀菌机理主要是作最强。紫外线杀菌机理主要是作最强。紫外线杀菌机理主要是作最强。紫外线杀菌机理主要是作用于细菌用于细菌用于细菌用于细菌DNADNADNADNA，使同一条，使同一条，使同一条，使同一条DNA DNA DNA DNA 链上相邻的两个胸腺链上相邻的两个胸腺链上相邻的两个胸腺链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变嘧啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变嘧啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变嘧啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变DNADNADNADNA的的的的分子构型，干扰细菌分子构型，干扰细菌分子构型，干扰细菌分子构型，干扰细菌DNADNADNADNA的复制与的复制与的复制与的复制与 转录，导致细菌转录，导致细菌转录，导致细菌转录，导致细菌的死亡或变异。紫外线穿透力差，故只适用于空气的死亡或变异。紫外线穿透力差，故只适用于空气的死亡或变异。紫外线穿透力差，故只适用于空气的死亡或变异。紫外线穿透力差，故只适用于空气及不耐热物品的表面消毒。及不耐热物品的表面消毒。及不耐热物品的表面消毒。及不耐热物品的表面消毒。uu2.2.2.2.电离辐射：电离辐射：电离辐射：电离辐射：高速电子、高速电子、高速电子、高速电子、X X X X 射线和射线和射线和射线和射线等在足够射线等在足够射线等在足够射线等在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于剂量时，对各种细菌均有致死作用。其机制在于 产生游离基，破坏细菌产生游离基，破坏细菌产生游离基，破坏细菌产生游离基，破坏细菌DNADNADNADNA。电离辐射常用于大量。电离辐射常用于大量。电离辐射常用于大量。电离辐射常用于大量一次性医用塑料制品的消毒。一次性医用塑料制品的消毒。一次性医用塑料制品的消毒。一次性医用塑料制品的消毒。3.3.滤过除菌滤过除菌uu滤过除菌是用物理阻留的方法将液体滤过除菌是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌的目的。或空气中的细菌除去，以达到无菌的目的。所用的器具是滤菌器（所用的器具是滤菌器（filterfilter）。）。滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、细菌毒素、抗生素，以及空气等的血清、细菌毒素、抗生素，以及空气等的除菌。的除菌。滤菌器的种类很多，目前常用的有滤滤菌器的种类很多，目前常用的有滤膜滤菌器、石棉滤菌器（亦称膜滤菌器、石棉滤菌器（亦称SeitzSeitz滤菌滤菌 器）、玻璃滤菌器等。器）、玻璃滤菌器等。（二）化学消毒法（二）化学消毒法用化学药品进行消毒的方法，由于化学用化学药品进行消毒的方法，由于化学药品对细菌及人体都有毒性，故只能用于体药品对细菌及人体都有毒性，故只能用于体表、医疗器械及周围环境等的消毒。表、医疗器械及周围环境等的消毒。杀菌机制：杀菌机制：（1 1）使菌体蛋白质变性或凝固；）使菌体蛋白质变性或凝固；（2 2）干扰细菌的酶系统和代谢；）干扰细菌的酶系统和代谢；（3 3）影响细菌胞浆膜的通透性。）影响细菌胞浆膜的通透性。消毒剂类别消毒剂类别名称名称浓度浓度(%)用途用途重金属盐重金属盐红汞红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞硫柳汞0.01生物制品防腐生物制品防腐氧化剂氧化剂高锰酸钾高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸过氧乙酸0.20.5塑料、玻璃、人造纤维消毒塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类卤素类碘液碘液2.5皮肤消毒皮肤消毒醇类醇类乙醇乙醇7075皮肤、体温计消毒皮肤、体温计消毒酚类酚类石炭酸石炭酸35地面、器皿表面和排泄物消毒地面、器皿表面和排泄物消毒来苏来苏35同上、也常用于手及皮肤消毒同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂表面活性剂新洁尔灭新洁尔灭0.1手术器械消毒手术器械消毒酸碱类酸碱类生石灰生石灰1:41:8排泄物、地面消毒排泄物、地面消毒染料染料龙胆紫龙胆紫24表浅创伤消毒表浅创伤消毒影响消毒灭菌效果的因素影响消毒灭菌效果的因素 uu1.1.1.1.消毒剂的性质、浓度和作用时间：消毒剂的性质、浓度和作用时间：消毒剂的性质、浓度和作用时间：消毒剂的性质、浓度和作用时间：一般情况下浓度越一般情况下浓度越一般情况下浓度越一般情况下浓度越大，作用时间越长，杀菌效果越好。但大，作用时间越长，杀菌效果越好。但大，作用时间越长，杀菌效果越好。但大，作用时间越长，杀菌效果越好。但95%95%95%95%的的的的 乙醇消毒乙醇消毒乙醇消毒乙醇消毒效果反不如效果反不如效果反不如效果反不如75%75%75%75%为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀菌作用。菌作用。菌作用。菌作用。uu2.2.2.2.微生物的种类与数量：微生物的种类与数量：微生物的种类与数量：微生物的种类与数量：同种消毒剂对不同微生物的杀同种消毒剂对不同微生物的杀同种消毒剂对不同微生物的杀同种消毒剂对不同微生物的杀菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力 比其他的比其他的比其他的比其他的菌强；菌强；菌强；菌强；70%70%70%70%乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。uu3.3.3.3.环境中有机物的影响：环境中有机物的影响：环境中有机物的影响：环境中有机物的影响：消毒环境中如有有机物存在，消毒环境中如有有机物存在，消毒环境中如有有机物存在，消毒环境中如有有机物存在，如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀菌效果。菌效果。菌效果。菌效果。2显微操作显微操作uu显微镜是微生物检验中最常用的精密光学仪器。uu显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。uu食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。普通显微镜的使用方法 uu1低倍镜观察 uu2高倍镜观察 uu3油浸镜观察 uu使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动，油浸镜所用的油要洁净。uu 普通显微镜的保养 uu(1)(1)观察完后，移去观察的载玻片标本。观察完后，移去观察的载玻片标本。uu(2)(2)用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2 23 3次，次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。uu(3)(3)转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。uu(4)(4)将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。本移动器的位置，罩上防尘套。uu镜头清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸镜头清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸 ，物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙物镜的清洗，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。染色方法染色方法(一一一一)简单染色法简单染色法简单染色法简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，观察细菌的形态。染上颜色，观察细菌的形态。(二二二二)复染色法复染色法复染色法复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法和抗酸性染色法。革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：两大类：染色反应呈蓝紫色的称为染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌，用，用GG+表示；表示；染色反应呈红色的称为染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌，用，用GG-表示。表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构细胞壁的成分和结构细胞壁的成分和结构细胞壁的成分和结构不同而造成的。不同而造成的。实验材料实验材料1.1.显显微微镜镜、香香柏柏油油、二二甲甲苯苯、擦擦镜镜纸纸、吸吸水水纸纸、接接种种环环、载载玻片、酒精灯等。玻片、酒精灯等。2.2.石石炭炭酸酸复复红红染染液液、草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫染染液液、碘碘液液、9595乙乙醇醇、蕃红染液蕃红染液3.3.菌种菌种实验内容与步骤实验内容与步骤(一一一一)细菌的简单染色步骤细菌的简单染色步骤细菌的简单染色步骤细菌的简单染色步骤 涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检1 1涂片涂片涂片涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，养物与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大涂布面不宜过大。2 2干燥干燥 涂涂片片最最好好在在室室温温下下使使其其自自然然干干燥燥，有有时时为为了了使使之之干干得得更更快快些些，可可将将标标本本面面向向上上，手手持持载载玻玻片片一一端端的的两两侧侧，小小心心地地在在酒酒精精灯灯上上高高处处微微微微加加热热，使使水水分分蒸蒸发发，但但切切勿勿紧紧靠靠火火焰焰或或加加热热时时间间过过长长，以防标本烤枯而变形以防标本烤枯而变形。3 3固定固定 手手持持载载玻玻片片的的一一端端，标标本本向向上上，在在酒酒精精灯灯火火焰焰外外层层尽尽快快的的来来回回通通过过2323次次，共共约约2323秒秒钟钟，并并不不时时以以载载玻玻片片背背面面加加热热触触及及皮皮肤肤，不不觉觉过过烫烫为为宜宜（不不超过超过6060）,放置待冷后放置待冷后，进行染色。进行染色。4 4染色染色 在在涂涂片片薄薄膜膜上上滴滴加加染染色色液液(石石炭炭酸酸复复红红、草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫或或美美蓝蓝任任选选一一种种)一一滴滴，使使染染色色液液覆覆盖盖涂涂片片，染色约染色约1min1min。5 5水洗水洗 斜斜置置载载玻玻片片，在在自自来来水水龙龙头头下下用用小小股股水水流流冲冲洗洗，直至直至洗下的水呈无色为止洗下的水呈无色为止。6 6干燥干燥 用用吸吸水水纸纸吸吸去去涂涂片片边边缘缘的的水水珠珠，置置于于室室温温下下自自然干燥。然干燥。用吸水纸时用吸水纸时切勿将菌体擦掉切勿将菌体擦掉。7 7镜检镜检(二二二二)细菌的革兰氏染色步骤细菌的革兰氏染色步骤细菌的革兰氏染色步骤细菌的革兰氏染色步骤 涂涂片片干干燥燥固固定定初初染染水水洗洗媒媒染染水水洗洗脱脱色色水水洗洗复染复染水洗水洗干燥干燥观察观察1 1取培养物分别做取培养物分别做涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。，方法均与简单染色的相同。2 2用用草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫染色染色1min1min后水洗。后水洗。3 3加加碘液碘液媒染媒染1min1min后水洗。后水洗。4 4斜斜置置载载玻玻片片，滴滴加加9595乙乙醇醇脱脱色色，至至流流出出的的乙乙醇醇不不现现紫紫色色 为为止，大约需时止，大约需时2030s2030s，随即水洗，随即水洗。5 5用用蕃红蕃红染液复染染液复染1min1min，水洗。，水洗。6 6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。的颜色。革兰氏染色图解革兰氏染色试剂 步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上 步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上 步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层 步骤4：风干 步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定步骤6：结晶紫染色1分钟 步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片 步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗 步骤9：酒精脱色至下滴液为无色，立即用蒸馏水冲洗 步骤10：番红复染1分钟，用蒸馏水轻轻冲洗 大肠杆菌（Escherichia coli）革兰氏染色图 革兰氏染色阴性杆菌（红色）金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus）革兰氏染色）革兰氏染色 革兰氏染色阳性球菌（紫色）注意事项注意事项注意事项注意事项1 1革兰氏染色成败的革兰氏染色成败的关键是脱色时间关键是脱色时间关键是脱色时间关键是脱色时间，如脱色过度，革兰，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰为革兰氏阴性菌；如脱色时氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须此必须 严格严格把握脱色时间。把握脱色时间。2 2 选用培养选用培养1818-2424小时菌龄小时菌龄小时菌龄小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌氏阳性菌转呈阴性反应。转呈阴性反应。4.培养基制备的基本方法和注意事项 uu4.1培养基配方的选定uu同一种培养基的配方在不同资料中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。4.2培养基的制备记录uu每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。4.3培养基成分的称取uu培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。4.4培养基各成份的混合和溶化uu使用不锈钢锅或大烧杯等加热溶化，不能使用不锈钢锅或大烧杯等加热溶化，不能用铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基用铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。在锅中溶化时、可先用中，使细菌不易生长。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时搅动、以防焦化，如发现有焦温水加热并随时搅动、以防焦化，如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。如为琼脂溶化，有成分完全溶化，直至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。水分，最后必须加以补足。4.5培养基pH的初步调正uu因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。4.6培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，必要时，采用过滤或其它应透明无显著沉淀，必要时，采用过滤或其它澄清方法。一般液体培养基可用滤纸过滤法，澄清方法。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。均匀而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。4.7培养基的分装uu培养基的分装培养基的分装uu分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的超过容器装盛量的2/32/3。容器口可用垫有防湿。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的为准。棉塞的2/32/3在试管内，在试管内，1/31/3在试管外。在试管外。其外还须用防水纸包扎。其外还须用防水纸包扎。uu（目前试管一般多有用螺旋盖，采用金属或塑（目前试管一般多有用螺旋盖，采用金属或塑料试管帽）。料试管帽）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，作为测定该批培养基最终pH之用。4.8培养基的灭菌uu一般培养基可采用一般培养基可采用121C121C高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1515分分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。规定，即可用此法灭菌。uu某些畏热成分，如糖类，应另行配成某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%20%或更高或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约无菌操作技术抽取和加入于经冷却约5050C C左右的左右的培养基中。培养基中。4.9培养基斜面和平板的制作 uu琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。uu制作平板培养基时，将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中，温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。uu平板的制作应在火旁进行，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入1012mL的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。4.10培养基的质量测试 uu每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pHpH。uu将全部培养基放入将全部培养基放入361C361C恒温箱培养过夜，恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。如发现有菌生长，即弃去。uu用有关的标准菌株接种用有关的标准菌株接种1 12 2管或瓶培养基，培管或瓶培养基，培养养24244848小时，如无菌生长或生长不好。应追小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。批培养基即应弃去，不能使用。4.11培养基的保存uu培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。5接种、分离纯化培养和菌种保存 uu5.1接种uu将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。5.1.1接种工具和方法 1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 图5-1接种和分离工具常用的接种方法有以下几种：uu(1)(1)划线接种划线接种 最常用，工具：接种环，最常用，工具：接种环，接种针，在斜面接种和平板划线中就常用此法。接种针，在斜面接种和平板划线中就常用此法。uu(2)(2)三点接种三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。在研究霉菌形态时常用此法。uu(3)(3)穿刺接种穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。能够生长。uuuu(4)浇混接种uu(5)涂布接种uu(6)液体接种 固体培养基液体培养基，液体培养物液体培养基，液体培养物固体培养基。uu(7)注射接种 疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。uu(8)活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。5.1.2无菌操作uu培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。uu在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。uu接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。种的器具必须经干热或火焰等灭菌。uu接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图（图5-25-2）然后，将接种环从柄部至环端逐渐）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。图5-2斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞 5.2分离纯化uu含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。5.2.1倾注平板法uu首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。图1倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解 1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水 稀稀释倒平板和涂布法倒平板和涂布法5.2.2涂布平板法uu首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图1 b）5.2.3平板划线法uu最简单的分离微生物的方法是平板划线法。最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图放射法、四格法等。（图2 2）当接种环在培养）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散生长，各自形成菌释，最后在所划的线上分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落形态及特征，挑选单个菌落，落，以便根据菌落形态及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌经过移种而获得纯种细菌 (纯培养纯培养)。图2平板划线分离法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 划划线接种示意接种示意图5.2.4富集培养法uu富集培养法的方法和原理非常简单。创造一些条件只让所需的微生物生长，使其能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。uu所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。5.2.5厌氧法uu为了分离某些厌氧菌，利用装有原培养基的试为了分离某些厌氧菌，利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。uu另一种方法是，在接种后，利用另一种方法是，在接种后，利用N N2 2或或COCO2 2取代取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。uu把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。5.3培养uu微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。5.3.1影响微生物生长的因素 uu一)营养物浓度 uu二)温度 uu根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型：uu(1)嗜冷微生物：其是适生长温度多数在-1020之间uu(2)中温微生物：其最适生长温度一般在2045之间 uu(3)嗜热微生物：生长温度在45以上。uu三）水分 uu四）氧气 uu(1)需氧微生物 uu(2)兼性需氧微生物 uu(3)微量需氧微生物 uu(4)耐氧微生物 uu(5)厌氧微生物 5.3.2培养方法 uu根据培养时是否需要氧气，可分为：uu好氧培养；uu厌氧培养。一）好氧菌的培养uu(1)固体表面培养法 uu(2)液体培养法 二)厌氧菌的培养 uu(1)深层穿刺培养uu(2)化学吸氧与深层穿刺相结合 uu(3)抽气法 5.4菌种保存 uu菌种保藏方法很多，但主要是根据以下原则而设计的：uu(1)必须选用典型优良纯培养物进行保藏，并尽量采用其休眠体，如细菌物芽孢，真菌的孢子等进行保藏；uu(2)创造有利于微生物休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧、缺乏营养以及添加保护剂等；uu(3)尽量减少传代次数。采用以上措施有利于达到长期保藏的目的。uu(1)低温保存 45左右的冻箱中贮存。一般细菌可保存13个月、酵母菌和霉菌可保存26个月后，再移种到新配的斜面培养基1次，经适当培养后，再行保藏。优点是操作简单，不需特殊设备；缺点是保藏时间短，菌种经反复转接后，遗传性状易发生变异，生理活性减退。斜面保藏法斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C4C 冰箱中冰箱中包藏。包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存放线菌及芽孢菌保存2 24 4个月移种一次，酵个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。是保藏时间短、易被污染。穿刺保藏法穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置用胶塞封严，置4 4冰箱存放。冰箱存放。矿物油保存 uu菌种在琼脂斜面上或在半固体琼脂试管中生长后，菌种在琼脂斜面上或在半固体琼脂试管中生长后，在试管中再加入无菌液体石蜡，覆盖在培养基上在试管中再加入无菌液体石蜡，覆盖在培养基上面，这样就会使菌种和培养基与外界空气隔离，面，这样就会使菌种和培养基与外界空气隔离，并可防止培养基水分蒸发，管口可用固体石蜡封并可防止培养基水分蒸发，管口可用固体石蜡封口，放置低温保存，至少保存口，放置低温保存，至少保存6 6个月至个月至1 1年。此法年。此法适于保藏霉菌、酵母菌和放线菌。但有些细菌和适于保藏霉菌、酵母菌和放线菌。但有些细菌和霉菌如固氮菌、乳杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉霉菌如固氮菌、乳杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉等不宜用此法保存。等不宜用此法保存。6微生物常规鉴定技术 uu6.1形态结构和培养特性观察 uu6.1.1微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。uu6.1.2微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。uu(1)细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。（图6-1）uu(2)(2)霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落似，只是比细菌菌落大且厚大且厚。液体培养也和细菌。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。uu霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。基内菌丝褐色。uu霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。状菌落。6.2生理生化试验uu6.2.16.2.1适应环境特性试验适应环境特性试验uu6.2.1.16.2.1.1生长温度的试验生长温度的试验uu微生物在一定的温度范围内能进行其生命活动。微生物在一定的温度范围内能进行其生命活动。如超出适宜温度的范围，便会产生不利影响，各如超出适宜温度的范围，便会产生不利影响，各种不同的微生物所需的最适温度各不相同。因此，种不同的微生物所需的最适温度各不相同。因此，一定要掌握好微生物的最适温度。一般病原菌的一定要掌握好微生物的最适温度。一般病原菌的最适温度是最适温度是3737，但在，但在10104545范围内均可生长。范围内均可生长。uu6.2.1.2生长pH试验uupH对微生物发育影响很大。有的细菌能耐酸如乳酸杆菌等；有的细菌能耐碱，如霍乱弧菌在pH9.2能生长。但大多数微生物的最适pH为7.27.6，pH过低或过高，则生长不良或不生长。uu6.2.1.36.2.1.3耐盐性试验耐盐性