最新微生物细胞破碎PPT课件.ppt

进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅长的时间隧道，袅微生物细胞破碎酶酶来源来源应用范围应用范围L-天冬酰氨酶天冬酰氨酶Eruinia CaratovoraEscherichia Coli治疗急性淋巴癌治疗急性淋巴癌过氧化氢酶过氧化氢酶Aspergillus niger牛奶灭菌后牛奶灭菌后H2O2的清除的清除胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶Nocardia hodochrous胆固醇浆液分析胆固醇浆液分析-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Kluyveromyces fragilisSaccharomyces lactis在牛奶在牛奶/乳清中乳糖的水解作乳清中乳糖的水解作用用葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶Aspergillus nigerPenicilluim notatum葡萄糖浆液分析葡萄糖浆液分析食品中氧的清除食品中氧的清除葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶Yeast临床分析临床分析蔗糖酶蔗糖酶Saccharomyces Cerevisiae糖果、蜜饯糖果、蜜饯青霉素酰化酶青霉素酰化酶Escherichia Coli苄青霉素的脱酰作用苄青霉素的脱酰作用表表1 胞内酶举例胞内酶举例细胞破碎的必要性细胞破碎的必要性N0和和N的确定方法：的确定方法：直直接接计计数数法法：通通过过平平板板计计数数技技术术或或血血球球细细胞胞器器上上用用显显微微镜镜观观察察，直直接接对对适适当当稀稀释释后后的的样样品进行计数。品进行计数。间间接接计计数数法法：在在细细胞胞破破碎碎后后，测测定定悬悬浮浮液液中中细细胞胞释释放放出出来来的的化化合合物物的的量量（eg.可可溶溶性性蛋蛋白、酶等）。白、酶等）。细胞破碎技术细胞破碎技术其他新的细胞破碎方法：其他新的细胞破碎方法：激光破碎法激光破碎法 冷冻冷冻-喷射法喷射法 高速相向流撞击法高速相向流撞击法细胞细胞声波声波搅拌搅拌液压液压冷冻压力冷冻压力动物细胞动物细胞7777革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌革兰氏阴性芽孢杆菌和球菌6566革兰氏阳性芽孢杆菌革兰氏阳性芽孢杆菌5(4)54酵母酵母3.5342.5革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌3.5(2)32.5孢子孢子2(1)21菌丝菌丝16(1)5表表3 细胞对破碎的敏感度细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。常用的破壁方法常用的破壁方法珠磨法珠磨法珠磨法珠磨法高压匀浆法高压匀浆法高压匀浆法高压匀浆法超声波破碎法超声波破碎法超声波破碎法超声波破碎法X-pressX-press法法法法机机械械法法非非非非机机机机械械械械法法法法酶溶法酶溶法酶溶法酶溶法化学渗透法化学渗透法化学渗透法化学渗透法渗透压法渗透压法渗透压法渗透压法冻结融化法冻结融化法冻结融化法冻结融化法干燥法干燥法干燥法干燥法常用的破壁方法常用的破壁方法珠磨法珠磨法作用机理：固体剪切作用作用机理：固体剪切作用图图3 水平搅拌式珠麿机结构示意图水平搅拌式珠麿机结构示意图1细胞悬浮液细胞悬浮液 2细胞匀浆液细胞匀浆液 3珠液分离器珠液分离器 4冷却液出口冷却液出口 5搅拌电机搅拌电机 6冷却液进口冷却液进口 7搅拌桨搅拌桨 8玻璃珠玻璃珠 破碎作用遵循一级动力学定律：破碎作用遵循一级动力学定律：破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：如：珠体的大小珠体的大小、珠体的装量珠体的装量、细胞浓度细胞浓度、操操作温度作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。、料液性质、搅拌器转速与构型等。此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。也有关系，如转盘外缘速度等。一一般般来来说说，磨磨珠珠越越小小，细细胞胞破破碎碎速速度度越越快快，但但太太小小易易于于漂漂浮浮，并并难难以以保保留留在在研研磨磨机机的的腔腔体体中中。通通常常实实验验室室规规模模，珠珠体体直直径径为为0.2mm0.2mm较较好好，工业规模不得小于工业规模不得小于0.4mm0.4mm。不不同同的的细细胞胞类类别别及及所所需需提提取取的的酶酶在在细细胞胞中中的位置等也是应考虑的因素。的位置等也是应考虑的因素。有有研研究究表表明明，减减小小磨磨珠珠直直径径起起先先会会提提高高卡卡乐乐酵酵母母蛋蛋白白质质的的释释放放速速度度，但但磨磨珠珠再再小小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。eg.eg.从从酵酵母母细细胞胞中中提提取取D-D-葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶，最最好好使使用用0.55-0.85mm0.55-0.85mm大大小小的的玻玻璃璃珠珠，而而在在提提取取-D-D-葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶时时，则则最最好好使用较大尺寸（如使用较大尺寸（如1mm1mm直径）磨珠。直径）磨珠。在在一一定定范范围围内内，增增加加珠珠体体装装填填量量可可以以提提高高细细胞胞破破碎碎率率。但但超超过过某某一一限限度度时时，反反不不利利于于细细胞破碎和蛋白质的释放。胞破碎和蛋白质的释放。为为消消除除这这种种影影响响，必必须须提提高高搅搅拌拌器器的的功功率率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。一一般般研研磨磨机机腔腔体体内内的的填填充充密密度度控控制制在在80%-80%-90%90%，并随珠体大小变化。，并随珠体大小变化。细细胞胞浓浓度度对对悬悬浮浮液液的的流流变变特特性性具具有有影影响响，最最佳佳的的细细胞胞浓浓度度应应用用实实验验来来确确定定。一一般般用用Netzsch Netzsch LM20LM20研研磨磨机机破破碎碎时时，细细胞胞浓浓度度控控制制在在40%40%左右。左右。CurrieCurrie等等人人的的研研究究表表明明，操操作作温温度度控控制制在在5-405-400 0C C范围内对破碎物的影响较小。范围内对破碎物的影响较小。常常采采用用冷冷却却夹夹套套和和搅搅拌拌轴轴的的方方式式来来调调节节磨磨室的温度。室的温度。作用机理：液体剪切作用作用机理：液体剪切作用常用的破壁方法常用的破壁方法高压匀浆高压匀浆图图5 高压匀浆机装置图高压匀浆机装置图 此此方方法法中中影影响响破破碎碎的的主主要要因因素素是是压压力力、温度和通过匀浆器的次数。温度和通过匀浆器的次数。有有研研究究表表明明，当当悬悬浮浮液液中中酵酵母母浓浓度度在在450-750kg/m450-750kg/m3 3时时，温温度度由由50500 0C C提提高高到到30300 0C C，破破碎率约提高碎率约提高1.51.5倍。倍。图图7细胞浓度及压力大小对破碎率的影响细胞浓度及压力大小对破碎率的影响 匀浆次数匀浆次数图图8 匀浆次数对破碎效果的影响匀浆次数对破碎效果的影响 常用的破壁方法常用的破壁方法超声波破碎超声波破碎作用机理：空化现象作用机理：空化现象 由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲击波的现象。击波的现象。超超声声波波振振动动在在液液体体中中传传播播的的音音波波压压强强达达到到1atm1atm时时，功功率率密密度度为为0.35 0.35 w/cmw/cm2 2，这这时时超超声声波波的的音音波波压压强强峰峰值值可可达达真真空空或或负负压压，但但实实际际上上无无负负压压存存在在，因因此此在在液液体体中中产产生生一一个个很很大大的的力力，将将液液体体分分子子拉拉裂裂成成空空洞洞一一空空化化核核。此此空空洞洞非非常常接接近近真真空空，在在超超声声波波压压强强反反向向达达到最大时破裂。到最大时破裂。图图10 USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机型微电脑控制超声波细胞粉碎机图图9 超声波细胞破碎仪的结构示意图超声波细胞破碎仪的结构示意图振幅振幅细胞悬浮液的黏度细胞悬浮液的黏度表面张力表面张力被处理悬浮液的体积被处理悬浮液的体积珠粒的体积和直径珠粒的体积和直径探头的形状和材料探头的形状和材料细胞悬浮液的流速细胞悬浮液的流速影响参数影响参数 常用酶：常用酶：溶溶菌菌酶酶、-1,3-1,3-葡葡聚聚糖糖酶酶、-1,6-1,6-葡葡聚聚糖糖酶酶、蛋蛋白白酶酶、甘甘露露糖糖酶酶、糖糖苷苷酶酶、肽肽键键内内切切酶、壳多糖酶等。酶、壳多糖酶等。常用的破壁方法常用的破壁方法酶溶法酶溶法 作用机理：作用机理：利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。eg.eg.蜗蜗牛牛酶酶从从蜗蜗牛牛的的嗦嗦囊囊和和消消化化道道中中制制备备的的混混合合酶酶，含含有有纤纤维维素素酶酶、果果胶胶酶酶、淀粉酶、蛋白酶等淀粉酶、蛋白酶等2020多种。多种。在在某某些些情情况况下下，不不加加外外源源酶酶也也可可使使某某些些微微生生物发生物发生自溶自溶。eg.eg.谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌）谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌）加入加入pH10pH10的缓冲液（的缓冲液（0.028mol/LNa0.028mol/LNa2 2COCO3 3 0.018mol/LNaHCO0.018mol/LNaHCO3 3 ），配配3%3%的的细细胞胞悬悬浮浮液液，加加热热至至70700 0C C，保温搅拌，保温搅拌20min20min，菌体即自溶。，菌体即自溶。所所用用的的化化学学试试剂剂：酸酸、碱碱、表表面面活活性性剂剂、脂脂溶溶性有机溶剂、性有机溶剂、EDTAEDTA鳌合剂、变性剂等。鳌合剂、变性剂等。常用的破壁方法常用的破壁方法化学渗透法化学渗透法 作作用用机机理理：改改变变细细胞胞壁壁或或膜膜的的通通透透性性，从从而使内含物有选择性地渗透出来。而使内含物有选择性地渗透出来。酸酸、碱碱：用用来来调调节节溶溶液液的的pH值值，改改变变细细胞胞所所处环境，改变蛋白质的电荷性。处环境，改变蛋白质的电荷性。有有机机溶溶剂剂：常常用用的的是是甲甲苯苯，被被细细胞胞壁壁脂脂质质层层吸吸收收后后导导致致胞胞壁壁膨膨胀胀，造造成成细细胞胞壁壁破破裂裂。此此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。表表面面活活性性剂剂：天天然然的的如如胆胆酸酸盐盐、磷磷酯酯，合合成成的的如如SDS、Tween、TritonX-100等。等。变变性性剂剂：如如盐盐酸酸胍胍，与与水水中中氢氢键键作作用用，消消弱弱溶溶质分子间的疏水作用。质分子间的疏水作用。eg.1.eg.1.某某些些动动物物细细胞胞（肿肿瘤瘤细细胞胞）可可采采用用SDSSDS、去去氧氧胆胆酸酸钠钠等等破破坏坏细细胞胞膜膜；而而细细胞胞壁壁较较厚，采用溶菌酶处理效果较好。厚，采用溶菌酶处理效果较好。2.2.用用TritonTriton从从一一种种诺诺卡卡氏氏菌菌中中选选择择性性地地提取胆固醇氧化酶。提取胆固醇氧化酶。l 温和化学渗透剂温和化学渗透剂 p温温和和化化学学渗渗透透剂剂一一般般是是采采用用甘甘氨氨酸酸、丙丙氨氨酸酸等分子量较小的非极性基氨基酸。等分子量较小的非极性基氨基酸。p其其破破碎碎机机理理可可能能是是因因为为小小分分子子的的甘甘氨氨酸酸、丙丙氨氨酸酸更更易易渗渗透透到到细细胞胞壁壁中中,通通过过氢氢键键、范范德德华华引引力力、静静电电引引力力等等化化学学亲亲和和力力改改变变细细胞胞壁壁结结构构,从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。细胞类别细胞类别变性剂变性剂清洁剂清洁剂有机溶剂有机溶剂 酶酶抗抗 生素生素生物试剂生物试剂鳌和剂鳌和剂革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌*革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌*酵母菌酵母菌*植物细胞植物细胞*巨噬细胞巨噬细胞*表表4 不同细胞可采用的化学渗透处理方式不同细胞可采用的化学渗透处理方式*表示适用表表5 机械破碎法与非机械破碎法的比较机械破碎法与非机械破碎法的比较细胞破壁技术注意事项细胞破壁技术注意事项 多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 与下游过程相结合与下游过程相结合 与上游过程相结合与上游过程相结合本章小结本章小结细胞破碎主要方法细胞破碎主要方法 细胞破碎机理图细胞破碎机理图思考:1 1、微生物细胞破碎的原因是什么？、微生物细胞破碎的原因是什么？有哪些具体的方法？有哪些具体的方法？2 2、G G+菌、菌、G G菌以及酵母菌细胞壁的菌以及酵母菌细胞壁的差别在哪里？差别在哪里？3 3、请指出珠磨法与高压匀浆法各自、请指出珠磨法与高压匀浆法各自的原理及适用范围。的原理及适用范围。4 4、细胞破壁应注意哪些问题？、细胞破壁应注意哪些问题？