最新微生物原生质体融合育种PPT课件.ppt
进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅长的时间隧道，袅微生物原生质体融合育种一、概述一、概述原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。原生质体：细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。植物细胞即细胞壁内的原生质部分;动物细胞就是原生质体。原生质体融合：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。Here comes your footer Page 2渗透压稳定剂：由于原生质体对渗透压非常敏感，渗透压稳定剂对于原生质体的制备起着重要作用。常用的渗透压稳定剂有KCl,NaCl,CaCl2,Mg SO4，等无机盐和蔗糖、甘露糖、山梨醇等，一般说来，丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜，而酵母菌则使用糖或醇做稳定剂比较好。Here comes your footer Page 9 原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生。不同微生物的原生质体最适再生条件存在一定的差异 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。3、原生质体再生、原生质体再生Here comes your footer Page 10原生质体悬浮液未酶解的细菌无菌水稀释高渗溶液稀释高渗溶液稀释培养培养培养计数再生率（%）=再生培养基上总菌落数酶处理后未原生质体化菌落数原生质体数100%总菌落数(A)未原生质化细胞（B)再生菌落(C)=CBAB100%再生率及其计算再生率及其计算Here comes your footer Page 11 所谓原生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加人物理的或者化学的或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。4、原生质体融合、原生质体融合Here comes your footer Page 12Here comes your footer Page 13聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG 分子中常有醚键，使其显示出弱的负电荷，可与水、蛋白质、糖类分子的正电基团形成氢键，而使原生质体连在一起发生凝集，这种作用还可以由于Ca+的存在而加强。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40 5 0%，分子量为6 0 0 0)，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是P E G融合技术的关键。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PE G 作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较低及经验性大等缺陷。近年来，一种物理融合技术 细胞电融合技术迅速崛起并显示出强大的生命力。PEG融合法融合法Here comes your footer Page 14从野生型或突变型菌株中选择两亲本收集菌体，酶解，获取原生质体以107108ml-1 的浓度混合加入30%50%PEG及适量的CaCl2、MgCl2维持在一定pH值的渗透压稳定剂中，适温处理110min再生培养基稀释45倍低速离心数分钟除去上清液，收集沉淀物0.1 mol/L CaCl2洗涤两次用融合液悬浮制备的融合体原生质融合过程Here comes your footer Page 15原生质体融合的影响因素原生质体融合的影响因素JPEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一般为40%。J促融时间：促融时间增加可以使原生质体融合机会增多，但是，PEG对原生质体有毒，为保证原生质体的再生能力，促融时间不宜过长。J无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率，融合时一般 Ca2+0.01 mol/L、Mg2+0.02 mol/L 为佳。各菌种间略有差异。Here comes your footer Page 16 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的不同加以选择。1.利用营养缺陷型标记选择融合体2.利用抗药性选择融合体3.利用灭活原生质体检出融合体4.利用荧光染色法选择融合体5.双亲对碳源利用不同而检出融合体6.利用形态差异检出5、融合体的检出与分离、融合体的检出与分离Here comes your footer Page 17这是一种传统而有效的选择方法，其检出原则是：融合的双亲带有不同的营养缺陷型标记，在分离培养基上只有融合体生长而不能让双亲形成的原生质体形成菌落。其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种物质的能力，它们在基体培养基上不能生长、繁殖，部分单亲原生质体的同源融合体也不能在基体培养基上形成菌落，只有双亲原生质体的融合体因营养物质互补而形成菌落。利用营养缺陷型标记选择融合体利用营养缺陷型标记选择融合体Here comes your footer Page 18 荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取现时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。具体方法：制备原生质体时，在酶解液中加入荧光色素，使双亲分别携带有不同的荧光标记。它对原生质体活力无影响，携带色素的原生质体能正常进行融合并具有再生能力。使用这种方法时，两种荧光染料的区分要明显，并注意染料的浓度和处理时间。利用荧光染色法选择融合体利用荧光染色法选择融合体Here comes your footer Page 19融合原生质体悬浮液稀释完全再生培养基选择性再生培养基培养培养重组体100%融合率（%）=选择性培养基上再生的菌落数完全培养基上再生的菌落数Here comes your footer Page 20三、原生质体融合的应用三、原生质体融合的应用提高产量或质量，合成新物质改良菌种遗传物性优化菌种发酵物性质粒转移原生质体与细胞核融合进行遗传分析Here comes your footer Page 21Here comes your footer Page 22
