基因工程专题5.ppt
基因工程专题5 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望4.目的基因的检测与鉴定：目的基因在受体细胞中目的基因的检测与鉴定：目的基因在受体细胞中是否稳定存在，是否表达是否稳定存在，是否表达?（1）分子水平的鉴定：）分子水平的鉴定：检测检测转基因生物染色体的转基因生物染色体的DNA上是否插入上是否插入目的基目的基因因-目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键；目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键；检测方法？检测方法？检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA 检测方法？检测方法？检测目的基因是否翻译出了蛋白质检测目的基因是否翻译出了蛋白质 检测方法？检测方法？（2）个体生物学水平的鉴定）个体生物学水平的鉴定 方法？方法？核酸探针：核酸探针：核酸探针是指带核酸探针是指带有放射性同位素有放射性同位素(如如32P)、荧、荧光分子等标记的特定已知序光分子等标记的特定已知序列的核酸片段，它能和与其列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。样品中特定基因序列的检测。包括包括DNA探针和探针和RNA探针。探针。核酸探针具有特异性，高度核酸探针具有特异性，高度的敏感性。的敏感性。核酸分子杂交：核酸分子杂交：互补的核苷互补的核苷酸序列通过酸序列通过碱基配对碱基配对形成稳形成稳定的杂合双链分子的过程称定的杂合双链分子的过程称为核酸分子杂交。为核酸分子杂交。完完把某一生物体内全部已知基因分别点到把某一生物体内全部已知基因分别点到DNA微列阵微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。情况。(1)斑点印迹斑点印迹(Dot-blot)将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80真空真空烘烤烘烤2h。(2)Southern印迹印迹(Southern blot)这是指将这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。分离后转移到固相支持物上的过程。(3)Northern印迹印迹(Northern blot)Northern印迹是指将印迹是指将RNA片段变性及片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组因组DNA,也可以是细胞总也可以是细胞总DNA或总或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。探针必须经过标即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法,例如，使用荧光分例如，使用荧光分子。子。固相杂交包括膜上印迹杂交和固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。2.杂交反应的基本过程杂交反应包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。杂交反应的基本过程杂交反应包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。预杂交的目的是用非特异性预杂交的目的是用非特异性DNA分子分子(鲑精鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA)及及其它高分子化合物其它高分子化合物(Denharts溶液溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避免这些位点与探针的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探闭，以避免这些位点与探针的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进行复性反应的过针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进行复性反应的过程。杂交反应结束后，应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交程。杂交反应结束后，应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后的标记探针，以避免干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后,将继续进行将继续进行杂交信号的检测。杂交信号的检测。基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以用图11-5-1来说明。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
