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基因操作原理 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望核酸的凝胶电泳扩增原理扩增原理分子杂交分子杂交测序测序核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快 凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型类型和密度密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。LMP琼脂糖 熔点：6265 熔解后，在37 可保持液态数小时；在25 可保持液态约10min 回收DNA分子 在65 下将LMP琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提DNA；离心获得含DNA分子的上清液；直接酶切 琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：1 TAE（TBE TPE）凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。能看到0.05 g的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比 Separation Range Vs.%AgaroseLow Geling Agarose 4-6 0.02-0.4 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit:5-10 ng DNA根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小Agarose gel electrophoresisAgarose gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10）。PolyAcrylamide Gels脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。107bp的DNA大分子。PFGE can resolve large DNA fragments基因扩增（gene amplification）主要内容：1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增PCRPCR技术技术 在在19831983年，美国年，美国CetusCetus公司人类遗传公司人类遗传研究室的科学家研究室的科学家K.B.MullisK.B.Mullis发明的。发明的。PCR PCR是一种在是一种在体外体外快速扩增快速扩增特定特定基因基因或或DNADNA序列的方法，有称之为体外扩序列的方法，有称之为体外扩增法。增法。(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min，60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。Reaction Condition for a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR AssayTypical PCR Thermal ProfileTypical PCR Thermal Profile*This cycle is normally included in a PCR assay in order to*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any“unfinished”product from previous amplification to allow any“unfinished”product from previous amplification to achieve its full lengthachieve its full lengthSome DNA Polymerases Used in PCRCharacteristics of Taq PolymeraseCharacteristics of Taq Polymerase PCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物 atggctant 3.嵌套引物嵌套引物 PCR扩增的长度：腺嘌呤腺嘌呤(A)的的N3 410倍倍 在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去移去2个磷酸分子，使个磷酸分子，使DNA链在甲基化的链在甲基化的鸟嘌呤鸟嘌呤G位点断裂。位点断裂。CS载体系统：末端标记载体载体系统：末端标记载体 核酸内切酶核酸内切酶Th111 特点：特点：1.产生产生5单碱基的突出末端，便于标记；单碱基的突出末端，便于标记；2.Th111 位点十分位点十分稀少稀少；3.5突出末端可以是突出末端可以是G或或A，也可以是，也可以是T 或或C，选择性强；，选择性强；4.在载体中具有两个在载体中具有两个Th111 位点，可对位点，可对克隆在载体上的片断任何一段作选择性克隆在载体上的片断任何一段作选择性标记。标记。化学修饰法的优点：化学修饰法的优点：1.不需要体外酶切；不需要体外酶切；2.只要有末端标记，无论只要有末端标记，无论单双链单双链都可用来都可用来测序。测序。250个个bp 限制因素：测序胶的分辨率限制因素：测序胶的分辨率 DNA测序分析的自动化测序分析的自动化 用四甲基若丹明（用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记作荧光剂，预先标记M13引物引物DNA5-末端，末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来或打印出来 DNA杂交测序（杂交测序（sequence by hybridization）SBH 原理：原理：如果一段短的如果一段短的DNA探针能够与较长的靶探针能够与较长的靶DNA片断杂交，并形成完全的双链体分子，片断杂交，并形成完全的双链体分子，那么我们便可以根据此来推断在靶那么我们便可以根据此来推断在靶DNA序序列长存在着相应的互补序列。列长存在着相应的互补序列。步骤：步骤：1.将待测的靶将待测的靶DNA分子与一组已知核苷分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交酸序列的寡核苷酸探针进行杂交 2.对能与待测对能与待测DNA杂交的探针之间的杂交的探针之间的碱基重叠关系作比较分析，据此推算靶碱基重叠关系作比较分析，据此推算靶DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。两种操作方式：两种操作方式：1.将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶靶DNA序列样品进行杂交序列样品进行杂交 2.应用寡核苷酸矩阵芯片的应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测杂交测序法序法 杂交的检测：杂交的检测：磷光成像仪和图象分析软件磷光成像仪和图象分析软件 错配错配的碱基会导致杂交信号强度下降。的碱基会导致杂交信号强度下降。6mer 500bp 7mer 2000bp 8mer 8000bp SBH的应用：的应用：1.检测靶检测靶DNA的单碱基突变的单碱基突变 2.用于不同片断之间的序列比较分析用于不同片断之间的序列比较分析 （同源性序列检测）（同源性序列检测）3.用表达序列标签（用表达序列标签（EST）的矩阵芯片，）的矩阵芯片，检测不同类型细胞中或不同生长发育状检测不同类型细胞中或不同生长发育状态下的细胞中特定基因的表达状况。态下的细胞中特定基因的表达状况。4.检测传统的测序技术所得检测传统的测序技术所得DNA片断的核片断的核苷酸序列数据。苷酸序列数据。