实验三 革兰氏染色.ppt
实验三 革兰氏染色 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验三实验三 革兰氏染色革兰氏染色实验目的2.掌握细菌涂片和革兰氏染色基本程序。掌握细菌涂片和革兰氏染色基本程序。1.理解革兰氏染色的原理。理解革兰氏染色的原理。革兰氏细菌的细胞壁结构革兰氏细菌的细胞壁结构实验原理革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖肽聚糖形成的网状结构组成的。形成的网状结构组成的。在在染染色色过过程程中中，当当用用乙乙醇醇处处理理时时，肽肽聚聚糖糖脱脱水水而而孔孔障障缩缩小小，通通 透透性性降降低低，使使结结晶晶紫紫-碘碘复复合合物物被被保保留留在在细细胞胞内内而而不不易易脱脱色色，因此，呈现蓝紫色，用因此，呈现蓝紫色，用G+表示。表示。实验原理革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶 解的解的类脂质类脂质含量高。含量高。当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使 结晶紫结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液的颜色，因此呈现红色，用染液的颜色，因此呈现红色，用G-表示。表示。实验器材（一）金黄色葡萄球菌（一）金黄色葡萄球菌,大肠杆菌大肠杆菌,土壤分离细菌。土壤分离细菌。（二）革兰氏染色液：（结晶紫染液；（二）革兰氏染色液：（结晶紫染液；LugolLugol碘液；碘液；95%95%乙乙 醇；稀释石炭酸复红染液），载玻片，酒精灯，接醇；稀释石炭酸复红染液），载玻片，酒精灯，接种环，吸水纸，香柏油，擦镜纸等。种环，吸水纸，香柏油，擦镜纸等。（三）光学显微镜。（三）光学显微镜。实验步骤一、细菌涂片的制作一、细菌涂片的制作 1.取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水，取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水，2.按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。2.再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片环涂在玻片 两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。3.将玻片反复在酒精灯上方通过几次（将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反用手指触摸涂片反面，以不烫手为宜面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。干燥）。待涂片冷却后，再加染色液。待涂片冷却后，再加染色液。涂片制作1.初染初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色 约约1分钟后水洗。分钟后水洗。2.媒染媒染：滴加：滴加Lugol碘液染色碘液染色1分钟，水洗。分钟，水洗。3.脱色脱色：把玻片上的水吸净，用：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出酒精滴洗玻片，直到滴出 的酒精刚好不出现紫色，大约的酒精刚好不出现紫色，大约20秒钟，立即用水洗。秒钟，立即用水洗。4.复染复染：滴加稀释石炭酸复红染液染色：滴加稀释石炭酸复红染液染色1-2分钟，水洗后涂片分钟，水洗后涂片用吸水纸吸干或者放空气中晾干。用吸水纸吸干或者放空气中晾干。二、革兰氏染色二、革兰氏染色革兰氏染色流程图革兰氏染色流程图(1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。(2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。(3)将将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。三、涂片观察三、涂片观察油镜工作原理油镜工作原理金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(1040)大肠杆菌大肠杆菌(1040)四四 实验完毕后的处理：实验完毕后的处理：1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯（用擦镜纸沾少许二甲苯（）将镜头擦将镜头擦2-3次。次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。注意擦镜头时向一个方向擦拭。2.镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。1.涂片后涂片后要注意固定、干燥，要注意固定、干燥，以免标本被冲洗掉。以免标本被冲洗掉。注意事项注意事项2.革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。酒精脱色。如果脱色如果脱色过度过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。如果脱色时间如果脱色时间过短过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格界定。难以严格界定。4.选用幼龄的细菌。选用幼龄的细菌。选用培养选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.染色过程中勿使染色液干涸染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的。用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。实验结果实验结果菌名菌名菌体颜色菌体颜色菌体形态菌体形态（图示）（图示）G+或或G-金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌土壤分离细菌土壤分离细菌实验思考实验思考1.为什么革兰氏染色后细菌会分出两种颜色？为什么革兰氏染色后细菌会分出两种颜色？2.革兰氏染色最关键的是哪一步，此时阳性菌和阴性菌各应该革兰氏染色最关键的是哪一步，此时阳性菌和阴性菌各应该 是哪种颜色，不经过复染这一步能不能区别革兰氏阳性菌和是哪种颜色，不经过复染这一步能不能区别革兰氏阳性菌和阴性菌？阴性菌？3.固定的目的之一是杀死细菌，这与用自然死亡的菌体进行染固定的目的之一是杀死细菌，这与用自然死亡的菌体进行染色有什么不同色有什么不同?
