NY∕T 4149-2022 动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程.pdf

动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程22中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX67.120.10CCS X41492022Technical code of practice for isolation and identification ofEscherichia coli from animals中华人民共和国农业农村部发 布2022?07?11发布2022?10?01实施41492022NY?/T41492022书 书 书2?前?言本文件按照?标准化工作导则?第?部分?标准化文件的结构和起草规则?的规定起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别专利的责任?本文件由农业农村部畜牧兽医局提出?本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口?本文件起草单位?中国兽医药品监察所?广东省农产品质量安全中心?本文件主要起草人?张纯萍?吴荔琴?赵琪?刘佩怡?宋立?肖田安?崔明全?伍宏凯?徐士新?刘燕?王鹤佳?动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程?范围本文件规定了大肠埃希菌?的分离与鉴定方法?本文件适用于动物直肠?泄殖腔拭子?粪便拭子?肠道内容物拭子等样品中大肠埃希菌的分离和鉴定?规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款?其中?注日期的引用文件?仅该日期对应的版本适用于本文件?不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?实验室?生物安全通用要求?兽医实验室生物安全要求通则?术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义?试剂或材料?要求除另有规定外?所有试剂均为分析纯?水为符合?规定的三级水?培养基按附录?配制或用商品化产品?试剂?氰?羟基肉硅酸?色谱纯?甘油?溶液制备?乳糖发酵管?按照附录?中?的规定执行?靛基质试剂?按照?的规定执行?甲基红试剂?按照?的规定执行?试剂?按照?的规定执行?基质溶液?取?氰?羟基肉硅酸?按说明书配制?或用市售商品?灭菌甘油?取甘油适量?灭菌?培养基制备?氏运送培养基?按照?的规定执行?麦康凯琼脂?按照?的规定执行?营养琼脂?按照?的规定执行?蛋白胨水?按照?的规定执行?缓冲葡萄糖蛋白胨水?按照?的规定执行?西蒙氏柠檬酸盐培养基?按照?的规定执行?蔗糖脱脂乳保护剂?按照?的规定执行?标准菌株?大肠埃希菌?材料?革兰氏染色套装?磁珠保藏管?革兰氏阴性细菌鉴定卡?盒?仪器设备?计?测量范围?精度为?单位?恒温培养箱?冰箱?及以下?二级生物安全柜?分析天平?感量?显微镜?高压灭菌锅?微生物生化鉴定系统?微生物质谱仪?分离与鉴定流程大肠埃希菌分离与鉴定流程见图?图?大肠埃希菌分离与鉴定流程?分离纯化取样品拭子?接种麦康凯琼脂平板?培养?挑取单个红色菌落?接种麦康凯琼脂平板?纯化培养?挑取纯化后单个菌落划线接种营养琼脂平板?培养?备用?形态观察与鉴定?形态观察?取纯化菌?革兰氏染色?镜检?呈红色?短直杆菌?单个或成对排列?鉴定?通用要求生化鉴定?质谱鉴定任选其一?生化鉴定?乳糖发酵试验取纯化菌?接种乳糖发酵管?培养?观察结果?乳糖发酵产酸产气者则液体变为黄色?小导管内产生气泡?靛基质试验取纯化菌?接种蛋白胨水?培养?加?靛基质试剂?上层出现红色环为阳性?黄色环为阴性?甲基红试验取纯化菌?接种缓冲葡萄糖蛋白胨水?培养?后?滴加甲基红试剂?滴?滴?立即观察结果?出现鲜红色为阳性?黄色为阴性?试验取纯化菌?接种缓冲葡萄糖蛋白胨水?培养?后?加入?萘酚?乙醇溶液?充分混匀?再加?氢氧化钾溶液?混匀?静置?观察?出现伊红色为阳性?柠檬酸盐利用试验取纯化菌?接种西蒙氏柠檬酸盐培养基斜面?培养?观察结果?培养基变为蓝色为阳性?不变色为阴性?结果判定按照?的生化试验项目进行鉴定?符合表?中生化反应特征即可判定为大肠埃希菌?也可选择革兰氏阴性细菌鉴定卡?盒?或微生物生化鉴定系统按操作说明进行鉴定?表?大肠埃希菌的生化试验项目及其反应特征生化试验项目反应特征乳糖发酵试验产酸产气?靛基质试验?甲基红试验?试验?柠檬酸盐利用试验?注?表示阳性?表示阴性?质谱鉴定?菌样制备挑取单个新鲜纯化菌落?均匀涂布于靶板样品孔中?涂布厚度为薄薄一层?室温干燥?吸取?基质溶液滴于样品上?混匀?室温干燥?标准菌株的新鲜菌落同法操作?仪器校准检测样品前?应对微生物质谱仪进行校准?测定取制备好的样品靶板?置于质谱仪靶板槽中?编辑样品信息后?进行谱图的数据采集?结果判定微生物质谱仪自动完成谱图的比对和鉴定?以不同颜色?不同分值显示结果?菌株鉴定位点显示绿色?鉴定分值达到种水平可信即可?大肠埃希菌标准菌株的质谱鉴定谱图见附录?菌株保藏取新鲜纯化菌?加无菌生理盐水制成菌悬液?与灭菌甘油溶液混合?使甘油终浓度为?或加入磁珠保藏管?或加入?蔗糖脱脂乳保护剂?冻干?或以下保藏?生物安全要求实验室设施设备?人员防护及实验安全操作?实验废弃物和菌种的处理应符合?的要求?附?录?规范性?培养基与试液?乳糖发酵管?成分蛋白胨?乳糖?溴甲酚紫?水?制法将?各成分溶解于水中?调节使灭菌后在?的?为?在分装试管中?每管?同时加入倒置小导管?小导管内不可有气泡?高压灭菌?备用?靛基质试剂?成分对二甲氨基苯甲醛?戊醇?盐酸?浓?制法将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇?缓慢加入浓盐酸?混匀?甲基红?试剂?成分甲基红?乙醇?水?制法将甲基红溶于?乙醇中?加入水?混匀?试剂?萘酚?乙醇溶液取?萘酚?加无水乙醇溶解?定容至?氢氧化钾溶液取氢氧化钾?加水溶解?定容至?氏运送培养?成分硫乙醇酸钠?氯化钠?磷酸氢二钠?氯化钙?琼脂?水?制法除琼脂外?取?中其余成分?混合?微温溶解?调节?使灭菌后在?的?为?加入琼脂?加热熔化?分装试管?高压灭菌?备用?麦康凯琼脂?成分蛋白胨?乳糖?牛胆盐?氯化钠?中性红?琼脂?水?制法除乳糖?中性红?琼脂外?取?中其余成分?混合?微温溶解?调节?使灭菌后在?的?为?加入乳糖?中性红?琼脂?加热溶解?高压灭菌?冷却至?倾注平板?备用?营养琼脂?成分蛋白胨?牛肉膏?氯化钠?琼脂?水?制法除琼脂外?取?中其余成分?混合?微温溶解?调节?使灭菌后在?的?为?加入琼脂?加热熔化?高压灭菌?冷却至?倾注平板?备用?蛋白胨水?成分胰蛋白胨?氯化钠?水?制法取?中各成分?混合?微温溶解?调节?使灭菌后在?的?为?分装试管?高压灭菌?备用?缓冲葡萄糖蛋白胨水?甲基红试验和?试验用?成分?蛋白胨?葡萄糖?磷酸氢二钾?水?制法除葡萄糖外?取?中各成分?混合?微温溶解?调节?使灭菌后在?的?为?加入葡萄糖?摇匀?分装试管?高压灭菌?备用?西蒙氏柠檬酸盐培养基?成分柠檬酸钠?氯化钠?磷酸氢二钾?磷酸二氢铵?硫酸镁?溴麝香草酚蓝?琼脂?水?制法除琼脂?溴麝香草酚蓝外?取?中其余成分?混合?调节?使灭菌后在?的?为?加入琼脂?溴麝香草酚蓝?加热熔化?分装试管?高压灭菌?制成斜面?备用?蔗糖脱脂乳保护剂?成分脱脂乳?蔗糖?水?制法取?中各成分?混合?高压灭菌?备用?附?录?资料性?大肠埃希菌的质谱鉴定谱图?大肠埃希菌?的质谱鉴定谱图见图?图?大肠埃希菌?的质谱鉴定谱图谱?