KJ 202102 水产品中组胺的快速检测.pdf

书 书 书食 品 快 速 检 验 方 法犓犑 水产品中组胺的快速检测 发布国家市场监督管理总局发 布书 书 书水产品中组胺的快速检测范围本方法规定了水产品中组胺的快速检测方法。本方法适用于水产品（鱼类等）中组胺的快速测定。第一法胶体金免疫层析法原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理，样品中的组胺经提取（或提取衍生）后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（线）与控制线（线）颜色深浅比较，对样品中组胺进行定性判定。试剂与材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 规定的二级水。试剂 无水乙醇（）。无水四氢呋喃（）。硝基苯甲酰氯（）。三羟甲基氨基甲烷（），即 。盐酸（，）。试剂配制 乙醇溶液（体积分数）：量取乙醇（），加水至 ，混合均匀。样品提取液：称取 （），加 乙醇（）溶解，充分混匀后，用盐酸（）调节值至，用 乙醇（）定容至 。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液。样品稀释液：称取 （），加 水溶解，充分混匀后用盐酸（）调节至，用水定容至 。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒专用稀释液。样品衍生剂（）：称取 硝基苯甲酰氯（），加 无水四氢呋喃（）溶解，用无水四氢呋喃（）定容至 。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒专用衍生剂。参考物质组胺参考物质的中文名称、英文名称、号、分子式、相对分子质量见表，纯度 。注：或等同可溯源物质。犓犑 表组胺参考物质的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称号分子式相对分子质量组胺 标准溶液配制组胺标准溶液（）：称取适量组胺参考物质（），准确至，置于 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度线，混匀，配成浓度为的组胺标准溶液。在 保存，有效期个月。注：组胺标准溶液的配制浓度以组胺单体计算，称取组胺参考物质时应进行折算。组胺参考物质：若为组胺（，相对分子质量 ），称取；若为组胺盐酸盐（，相对分子质量 ），称取；若为组胺磷酸盐（，相对分子质量 ），称取 。材料组胺胶体金免疫层析试剂盒：含胶体金检测卡及配套的试剂。仪器和设备 电子天平：感量分别为 和 。计。组织粉碎机。涡漩混合器。离心机：转速 。移液器：、和。读数仪（可选）：产品配套可使用的检测仪器。环境条件 温度 。空气相对湿度。分析步骤 试样制备去头、骨、内脏、鱼皮，取约 肌肉，用组织粉碎机充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于 保存。试样提取 方法一（衍生测定法）称取试样 于 离心管中，加入 样品提取液（），涡漩或剧烈振荡，离心，取 离心后的上清液，依次加入 样品提取液（）、样品衍生剂（），充分混匀后，室温下静置，即为样品处理液，按以下稀释操作，获取待测液：犓犑 高组胺鱼类（指鲐鱼、?鱼、竹荚鱼、鲭鱼、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼、马鲛鱼、青占鱼、沙丁鱼等青皮红肉海水鱼）：取 样品处理液，加入 样品稀释液（），混匀，即为待测液。其他海水鱼类：取 样品处理液，加入 样品稀释液（），混匀，即为待测液。方法二（直接测定法）称取试样 于 离心管中，加入 样品提取液（），涡漩或剧烈振荡，离心，上清液即为样品处理液，按以下稀释操作，获取待测液：高组胺鱼类（指鲐鱼、?鱼、竹荚鱼、鲭鱼、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼、马鲛鱼、青占鱼、沙丁鱼等青皮红肉海水鱼）：取？样品处理液，加入 样品稀释液（），混匀，即为待测液。其他海水鱼类：取 样品处理液，加入 样品稀释液（），混匀，即为待测液。注：请根据所采用的检测卡选择对应的试样提取方法，试样提取可按照试剂盒说明书进行操作，不做限定。测定步骤测试前，将未开封的检测卡恢复至室温。吸取 样品待测液于检测卡的加样孔中，室温温育 ，直接进行结果判定。注：测定步骤建议按照试剂盒说明书。注：结果判定建议使用读数仪，读数仪的具体使用参照仪器使用说明书。质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。空白试验采用经参比标准 食品安全国家标准食品中生物胺的测定第一法液相色谱法检测不含组胺的试样作空白试样。称取空白试样，按照 和 步骤与样品同法操作。加标质控试验称取空白试样 于 离心管中，加入 组胺标准溶液（）（），使组胺含量为 （高组胺鱼类）或 （其他海水鱼类），按照 和 步骤与样品同法操作。结果判定 读数仪测定结果按读数仪说明书要求操作，直接读数并进行结果判定。目视判定通过对比控制线（线）和检测线（线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图。无效控制线（线）不显色，无论检测线（线）是否显色，均表示实验结果无效。犓犑 阳性结果控制线（线）显色，若检测线（线）不显色或颜色浅于控制线（线），表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限，判为阳性。阴性结果控制线（线）显色，若检测线（线）颜色深于或等于控制线（线），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限，判为阴性。图目视判定示意图 质控试验要求空白试样测定结果应为阴性，加标质控样品测定结果应为阳性。结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。性能指标 检出限高组胺鱼类 ，其他海水鱼类 。灵敏度灵敏度。特异性特异性。假阴性率假阴性率。假阳性率假阳性率。注：性能指标计算方法见附录。犓犑 其他本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为 食品安全国家标准食品中生物胺的测定第一法液相色谱法（包括所有的修改单）。第二法偶氮试剂法比色卡法 原理样品中的组胺经提取后，通过正戊醇萃取净化，再与偶氮试剂反应生成橙色化合物，其颜色的深浅在一定范围内与组胺含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，对样品中组胺进行定性判定。试剂与材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 规定的二级水。试剂 三氯乙酸（）。氢氧化钠（）。正戊醇（）。盐酸（，）。碳酸钠（）。对硝基苯胺（）。亚硝酸钠（）。试剂配制 三氯乙酸溶液（）：称取 三氯乙酸（），用水溶解并稀释至 ，有效期个月。氢氧化钠溶液（）：称取 氢氧化钠（），用水溶解并稀释至 ，有效期个月。盐酸溶液（）：吸取 盐酸（），用水稀释至 ，混匀，有效期个月。碳酸钠溶液（）：称取 碳酸钠（），用水溶解并稀释至 ，有效期个月。对硝基苯胺溶液（）：称取 对硝基苯胺（），加盐酸（）超声溶解，用水稀释至 ，混匀，置于冰箱中保存，有效期个月。亚硝酸钠溶液（）：称取亚硝酸钠（），用水溶解并稀释至 ，混匀，有效期犓犑 个月。偶氮试剂：吸取对硝基苯胺溶液（）和亚硝酸钠溶液（），混匀，临用前配制。参考物质组胺参考物质的中文名称、英文名称、号、分子式、相对分子质量见表，纯度 。注：或等同可溯源物质。表组胺参考物质的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称登录号分子式相对分子质量组胺 标准溶液配制 组胺标准储备液（）：准确称取适量组胺参考物质（），置于 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，混匀，配制成质量浓度为的组胺标准储备液，置于 冰箱中保存，有效期个月。注：组胺标准溶液的配制浓度以组胺单体计算，称取组胺参考物质时应进行折算。组胺参考物质：若为组胺（，相对分子质量 ），称取；若为组胺盐酸盐（，相对分子质量 ），称取；若为组胺磷酸盐（，相对分子质量 ），称取。材料水产品中组胺快速检测试剂盒（比色卡法），需置于冰箱中保存。仪器和设备 电子天平：感量分别为 和 。组织粉碎机。离心机：转速 。涡漩混合器。移液器：、和。环境条件 温度 。空气相对湿度。分析步骤 试样制备去头、骨、内脏、鱼皮，取约 肌肉，用组织粉碎机充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于 保存。犓犑 试样提取准确称取试样 ，置于 离心管中，加三氯乙酸溶液（），摇匀后，涡漩，离心。取上清液 于 离心管中，加入 氢氧化钠溶液（），加入正戊醇（），涡漩，离心。取上清液 于 离心管中，加入盐酸溶液（），涡漩，离心。取下层液作为提取液。注：试样提取可按照试剂盒说明书进行操作，不做限定。测定步骤准确吸取提取液 于离心管中，加入 碳酸钠溶液（）摇匀，再加入 偶氮试剂（）混匀，放置 。与标准色阶卡目视比色，内判读结果。需进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。质控试验每批试样应同时进行空白试验和加标质控试验。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。空白试验采用经参比标准 食品安全国家标准食品中生物胺的测定第一法液相色谱法检测不含组胺的试样作空白试样。称取空白试样，按照 和 步骤与试样同法操作。加标质控试验准确称取空白试样 ，置于 离心管中，加入 组胺标准储备液（）（），使试样中组胺含量为 ，加入 三氯乙酸溶液（），以下按 自“摇匀后，涡漩”起依次操作至 结束。结果判定观察待测液的颜色，与标准色阶卡比较判读样品中组胺的含量。颜色浅于检出限（）则为阴性样品；颜色深于检出限的根据颜色的深浅进行判读。对于高组胺鱼类（鲐鱼、?鱼、竹荚鱼、鲭鱼、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼、马鲛鱼、青占鱼、沙丁鱼等青皮红肉海水鱼），当测定结果 时，判定为阳性；对于其他海水鱼类，当测定结果 时，判定为阳性。色阶卡见图。图组胺色阶卡质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应与加标量相符。犓犑 结论由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则。当测定结果为阳性时，应对结果进行确证。性能指标 检出限 。灵敏度灵敏度。特异性特异性。假阴性率假阴性率。假阳性率假阳性率。注：性能指标计算方法见附录。其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况。本方法参比标准为 食品安全国家标准食品中生物胺的测定第一法液相色谱法（包括所有的修改单）。本方法可能与酪胺存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。犓犑 附录犃（规范性）定性方法性能指标计算表表 规定了文件中定性方法各个性能指标的计算方法。表犃 定性方法性能指标计算表样品情况检测结果阳性阴性总数阳性犖 犖 犖犖 犖 阴性犖 犖 犖犖 犖 总数犖 犖 犖 犖 犖 犖 犖犖犖或犖 犖 显著性差异（）（犖 犖）（犖 犖），自由度（犱犳）灵敏度（狆）狆犖 犖 特异性（狆）狆犖 犖 假阴性率（狆犳）狆犳犖 犖 灵敏度假阳性率（狆犳）狆犳犖 犖 特异性相对准确度（犖 犖）（犖犖）注：犖：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：犖 表示第一行，第一列；犖表示所有的第一行，犖 表示所有的第二列；犖 表示第一行，第二列。由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法牵头单位：厦门市食品药品质量检验研究院。本方法胶体金免疫层析法起草单位：厦门市食品药品质量检验研究院。胶体金免疫层析法验证单位：广东省食品检验所、深圳市计量质量检测研究院、南京工业大学（国家轻工业食品质量监督检测南京站）、广州市食品检验所、厦门市疾病预防控制中心。本方法胶体金免疫层析法主要起草人：骆和东、叶雅真、徐振林、张志成、刘耀慧、张世伟、雷红涛、汪开银、王宇。本方法偶氮试剂法起草单位：南京工业大学（国家轻工业食品质量监督检测南京站）。本方法偶氮试剂法验证单位：厦门市食品药品质量检验研究院、江苏省食品药品监督检验研究院、江苏省产品质量监督检验研究院、江苏省理化测试中心、南京市产品质量监督检验院。本方法偶氮试剂法主要起草人：熊晓辉、聂小林、汪开银、骆和东、徐春祥、周玮、高宏、肖有玉。犓犑