实验二总糖和还原糖的测定.ppt

实验二 总糖和还原糖的测定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望掌握掌握3，5二硝基水杨酸法测定待测二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和还原糖含量的基本原理，样品的总糖和还原糖含量的基本原理，学会处理学会处理721型或型或722型分光光度计出型分光光度计出现的问题现的问题 一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。原糖以葡萄糖含量计）。本实验是利用本实验是利用3，5二硝基二硝基水杨酸溶液（水杨酸溶液（DNS法）与还法）与还原糖溶液共热后被还原成棕原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关质深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。简便，快速，杂质干扰较少。三、实验步骤三、实验步骤1、葡萄糖、葡萄糖标准曲准曲线的制定的制定 葡萄糖葡萄糖标准液的配制：准确称取准液的配制：准确称取100mg分分析析纯的无水葡萄糖（的无水葡萄糖（预先在先在105干燥至恒干燥至恒重），用少量蒸重），用少量蒸馏水溶解后，定量水溶解后，定量转移到移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。匀。浓度度为1mg/ml。取取7支支25250mm的试管，分别按下表加入试剂：的试管，分别按下表加入试剂：管管 号号0123456葡萄糖葡萄糖标标准液（准液（ml）00.20.40.60.81.01.2相当于葡萄糖量相当于葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.2蒸蒸馏馏水（水（ml）2.01.81.61.41.21.00.83,5二硝基水二硝基水杨杨酸酸(ml)1.51.51.51.51.51.51.5将各管溶液混合均匀，沸水浴加热将各管溶液混合均匀，沸水浴加热5min，取出后立，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，蒸馏水，摇匀。于摇匀。于520nm波长处测定波长处测定OD值。以葡萄糖毫克数值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品中品中总糖糖和和还原糖原糖含量的含量的测定定 （1）样品中品中还原糖原糖的提取：的提取：准确称取准确称取10g新新鲜材料（或材料（或2g材料干材料干样粉粉末），放在末），放在100ml烧杯中，先以少量水杯中，先以少量水调成糊成糊状，然后加状，然后加5060ml蒸蒸馏水，于水，于50恒温水恒温水浴中保温浴中保温20min，过滤，将，将滤液收集在液收集在100ml容量瓶中，再定容至容量瓶中，再定容至100ml。（2）样品中）样品中总糖总糖的水解提取：的水解提取：准确称取准确称取10g新鲜材料（或新鲜材料（或1g材料干样粉末），材料干样粉末），放在锥形瓶中，加入放在锥形瓶中，加入10ml 6 molL-1 盐酸，盐酸，15ml水，在沸水浴中加热水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于白，取出一、二滴置于白瓷板上，加瓷板上，加1滴碘碘化钾溶液检查水解是否完全。滴碘碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚滴酚酞指示剂，以酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上述溶液。再精确吸取上述溶液10ml于于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。（3）样品中糖含量的测定：）样品中糖含量的测定：取取7支支25250mm试管分别按下表加入试剂：试管分别按下表加入试剂：管管 号号空白空白还原糖还原糖总糖总糖0123123样品溶液（样品溶液（ml）01.01.01.01.01.01.0蒸馏水（蒸馏水（ml）21.01.01.01.01.01.03,5二硝基水杨酸二硝基水杨酸(ml)1.51.51.51.51.51.51.5OD加完试剂后，与制作标准曲线时加完试剂后，与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。相同的操作测定样品糖含量。四、实验结果四、实验结果在在ExcelExcel绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。以表格形式列出实验数据，取样品的以表格形式列出实验数据，取样品的ODOD520520平均值用标平均值用标准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。中还原糖与总糖的含量。还原糖还原糖（mgg-1）=还原糖毫克数还原糖毫克数提取液总体积提取液总体积（ml）稀释倍数稀释倍数测定用提取液体积（测定用提取液体积（ml）样样品重量（品重量（g）总糖（总糖（mgg-1）=样品水解后还原糖毫克数样品水解后还原糖毫克数提取液总体积（提取液总体积（ml）稀释倍数稀释倍数测定用提取液体积（测定用提取液体积（ml）样品重量（样品重量（g）五、讨论分析五、讨论分析1、在被、在被测样品中，品中，还原糖可能是些什么糖？原糖可能是些什么糖？总糖糖包括哪些？包括哪些？2、用来、用来测定定总糖的糖的样品，品，为什么要加什么要加盐酸水解？酸水解？而在其而在其测定前，又定前，又为何要用何要用NaOH中和？中和？3、标准葡萄糖准葡萄糖浓度梯度和度梯度和样品含糖量的品含糖量的测定定为什什么么应该同步同步进行？比色行？比色时设0号管有什么意号管有什么意义？六、改进实验建议六、改进实验建议附：仪器和试剂附：仪器和试剂主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管，主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管，移液管等。移液管等。3,5-二硝基水杨酸试剂：二硝基水杨酸试剂：甲液：溶解甲液：溶解6.9g结晶酚于结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液中，并用水稀释至并用水稀释至69ml，在此溶液中加，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠。乙液：称取乙液：称取255g酒石酸钾钠加到酒石酸钾钠加到300ml 10%氢氧化钠溶氢氧化钠溶液中，再加入液中，再加入880ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液。二硝基水杨酸溶液。将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温放置在室温放置7-10天后使用。天后使用。6 molL-1 盐酸盐酸10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液酚酞指示剂酚酞指示剂碘碘化钾溶液：称取碘碘化钾溶液：称取5g碘，碘，10g碘化钾溶于碘化钾溶于100ml蒸馏蒸馏水中。水中。