实验八 总RNA提取和反转录教案.ppt

实验八 总RNA提取和反转录 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验目的：实验目的：1.掌握掌握TRIZol试剂法提取细胞总试剂法提取细胞总RNA的原理和实验步骤；的原理和实验步骤；2.掌握反转录（掌握反转录（RT）的基本原理和操作步骤。）的基本原理和操作步骤。总总RNA提取提取反转录反转录（RT）聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）检测目的基因的表达：检测目的基因的表达：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提溶剂抽提RNA，样品分成水样层和有机层，样品分成水样层和有机层，RNA存在于存在于水样层中水样层中。收集水样层后，通过异丙醇沉淀。收集水样层后，通过异丙醇沉淀RNA，再经，再经过洗涤、晾干、最后溶解等步骤即得到相对较纯的过洗涤、晾干、最后溶解等步骤即得到相对较纯的RNA。反转录是在反转录酶的作用下，以反转录是在反转录酶的作用下，以总总RNA中中mRNA为为模板合成模板合成cDNA的过程的过程。实验原理：实验原理：1TRIzol试剂：主要成分是苯酚，它能裂解细胞，使细胞中的蛋试剂：主要成分是苯酚，它能裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚并得到释放。此外，白、核酸物质解聚并得到释放。此外，TRIzol中还有中还有8-羟基喹啉、羟基喹啉、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。2氯仿：与酚一起作用，使蛋白质变性；抽提水相中残留的酚，氯仿：与酚一起作用，使蛋白质变性；抽提水相中残留的酚，减少减少RNA损失。损失。3异丙醇：沉淀核酸。异丙醇：沉淀核酸。475乙醇（乙醇（DEPC水配制）：去除水配制）：去除RNA沉淀中的盐分。沉淀中的盐分。试剂的用途：试剂的用途：实验步骤：实验步骤：1.取取1/3小鼠完整肝组织（约小鼠完整肝组织（约1g），直接加入，直接加入4mL TRIzol试剂。试剂。用匀浆器进行匀浆处理，室温放置用匀浆器进行匀浆处理，室温放置5分钟分钟,每组取每组取0.5mL。2.加入加入0.1mL氯仿，剧烈振荡氯仿，剧烈振荡15s，室温放置，室温放置3min。3.10000rpm离心离心5min，RNA主要在上层水相中主要在上层水相中。转移。转移0.3mL水水相至新的离心管中。相至新的离心管中。4.加入加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置异丙醇，轻轻混匀，室温静置5 min。5.10000rpm离心离心5 min，弃上清。，弃上清。6.加入加入1mL 75乙醇，轻轻洗涤乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，沉淀，10000rpm离心离心5min，弃上清。，弃上清。7.室温晾干室温晾干(约约510min)。8.加入加入100L无无RNase水溶解水溶解RNA，取，取50L用于用于A260和和A280值测定。值测定。9.计算计算RNA的浓度和的浓度和A260/A280值值总总RNA提取提取1只小鼠只小鼠/小班小班，3个匀浆器个匀浆器/小班小班1.提取总提取总RNA和反转录的整个过程都要严格控制和反转录的整个过程都要严格控制RNase的污染。的污染。操作者要配带口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均操作者要配带口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均需要灭活需要灭活RNase。2.反转录中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是温度缓慢下降，反转录中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是温度缓慢下降，否则否则RNA可能局部复性降低反转录的效率。可能局部复性降低反转录的效率。3.反转录的反应中对反转录的反应中对RNA浓度有比较高的要求，因此必需测定浓度有比较高的要求，因此必需测定RNA浓度。只有保证浓度。只有保证RNA浓度在合适的范围内才能提高扩增的成浓度在合适的范围内才能提高扩增的成功几率。功几率。注意事项注意事项:28S18S5S,5.8S 1 2（A）（B）(A)细胞总细胞总RNA的制备的制备;(B)RT-PCR分析分析TBX5在不同细胞中的表达在不同细胞中的表达思考题：思考题：1.RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要的抽提中主要可用哪几种？可用哪几种？2.在提取总在提取总RNA和反转录的过程中，如何避免和反转录的过程中，如何避免RNase的污染？的污染？