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修改第九章植物病毒病害及脱毒ppt课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 第一节第一节 植物病毒病害的概述植物病毒病害的概述 目前在高等植物中，发现的病毒病已超过目前在高等植物中，发现的病毒病已超过700700种，数量仅次于种，数量仅次于真菌性病害。真菌性病害。一、植物病毒病概念一、植物病毒病概念 指由病毒和类似病毒的微生物如类病毒、植原体、螺原体指由病毒和类似病毒的微生物如类病毒、植原体、螺原体以及类细菌等引起的一类植物病害。植物病毒必须在寄主细胞内以及类细菌等引起的一类植物病害。植物病毒必须在寄主细胞内营寄生生活，专一性强，某一种病毒只能侵染某一种或某些植物，营寄生生活，专一性强，某一种病毒只能侵染某一种或某些植物，但也有少数为害广泛。但也有少数为害广泛。二、植物病毒病症状二、植物病毒病症状 受害植物常表现如下症状：受害植物常表现如下症状：1 1 变色变色 2 2 坏死坏死3 3 畸形畸形Symptoms of common viral diseases植物病毒症状植物病毒症状黄瓜花叶病毒病：黄瓜花叶病毒病：皱缩皱缩 ,卷叶卷叶,黄化黄化褪绿褪绿大白菜病毒病大白菜病毒病辣椒病毒病辣椒病毒病萝卜花叶毒病萝卜花叶毒病番茄病毒病番茄病毒病 黄瓜花叶病毒病：黄瓜花叶病毒病：三、植物病毒感染方式三、植物病毒感染方式1 1 植物病毒通过寄主的伤口感染植物病毒通过寄主的伤口感染-农田操作、人工移植、农田操作、人工移植、摘心、整枝、打杈。摘心、整枝、打杈。2 2植物病毒通过动物传播感染植物病毒通过动物传播感染 -传播介体除昆虫外，还有传播介体除昆虫外，还有真菌、线虫、菟丝子等。真菌、线虫、菟丝子等。3 3植物病毒通过染病植物营养器官传播植物病毒通过染病植物营养器官传播营养繁殖体感染下营养繁殖体感染下一代。一代。4 4、种子和花粉传播、种子和花粉传播部分豆科植物的种子。部分豆科植物的种子。目前，在生产上尚无特效药彻底消除目前，在生产上尚无特效药彻底消除植物体内的病毒，但通过组织培养却可以实植物体内的病毒，但通过组织培养却可以实现现消除植物体内的病毒消除植物体内的病毒；因此，组织培养脱；因此，组织培养脱毒显得非常重要；毒显得非常重要；第二节第二节 植物脱毒技术植物脱毒技术一、植物脱毒的机理一、植物脱毒的机理 病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无毒或含毒量极低。布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无毒或含毒量极低。较老组织的含毒量随着与茎尖距离的加大而增加。较老组织的含毒量随着与茎尖距离的加大而增加。植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着竞争。在旺盛分裂的细胞植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着竞争。在旺盛分裂的细胞中植物核蛋白合成占优势，在细胞伸长生长期间病毒核蛋白合成中植物核蛋白合成占优势，在细胞伸长生长期间病毒核蛋白合成占优势。占优势。病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，胞间连丝和维管组织还不健全。织中，胞间连丝和维管组织还不健全。在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖。茎尖培在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒的增殖。茎尖培养主要用于消除病毒以及类病毒、类菌质体、细菌和真菌等病原养主要用于消除病毒以及类病毒、类菌质体、细菌和真菌等病原物。物。二、植物脱毒的方法二、植物脱毒的方法（一）物理脱毒法（一）物理脱毒法 1 1 热处理脱毒热处理脱毒 植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。但每种植物都有其临界温度范围，超过这一临界范围或在此范围但每种植物都有其临界温度范围，超过这一临界范围或在此范围内处理时间过长，都会导致寄主植物组织受伤。为此可使用变温内处理时间过长，都会导致寄主植物组织受伤。为此可使用变温的处理方法，高（的处理方法，高（4040）和低温（）和低温（16162020）交替处理，既能保）交替处理，既能保证植物材料不受伤害，又能除去病毒。证植物材料不受伤害，又能除去病毒。（1 1）温汤浸渍处理）温汤浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在的材料，在5050左右的温水中浸渍左右的温水中浸渍1010分钟至数小时，方法简分钟至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。便易行，但易使材料受伤。（2 2）热空气处理）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35354040，短则几十分中长可达数月。，短则几十分中长可达数月。植物生长区与热处理区关系植物生长区与热处理区关系温度温度生生长长量量 热处理区热处理区病原菌被消除病原菌被消除寄主被杀死寄主被杀死2 2低温处理脱毒低温处理脱毒 低温处理亦称冷疗法，菊花植株在低温处理亦称冷疗法，菊花植株在55下，经下，经4 47.57.5个个月处理后，切取茎尖进行离体培养，可以有效去除菊花矮化月处理后，切取茎尖进行离体培养，可以有效去除菊花矮化病毒与菊花褪绿斑驳病毒，仅茎尖培养则无此效果，目前低病毒与菊花褪绿斑驳病毒，仅茎尖培养则无此效果，目前低温脱毒的报道尚少，但不失为一种脱毒的方法。温脱毒的报道尚少，但不失为一种脱毒的方法。（二）化学脱毒法（二）化学脱毒法 化学脱毒法的代表是抗病毒药剂处理脱毒。用于植物脱毒的抗化学脱毒法的代表是抗病毒药剂处理脱毒。用于植物脱毒的抗病毒药剂主要包括嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等。病毒药剂主要包括嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等。近年来，在脱毒生产中，经常采用且效果较好的抗病毒药剂有：近年来，在脱毒生产中，经常采用且效果较好的抗病毒药剂有：病毒唑病毒唑 抗病毒醚和抗病毒醚和DHTDHT（三）生物脱毒法（三）生物脱毒法1 1茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒 植物的根尖和茎尖等顶端组织不带病毒。但不含有病毒的植物的根尖和茎尖等顶端组织不带病毒。但不含有病毒的部分不超过部分不超过0.10.10.5mm0.5mm。这是因为分生区域内无维管束，病毒只。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，其传递速度不如细胞不断分裂和活跃的生能通过胞间连丝传递，其传递速度不如细胞不断分裂和活跃的生长速度。这样小的无病毒组织，利用常规方法无法繁殖利用。自长速度。这样小的无病毒组织，利用常规方法无法繁殖利用。自组织培养技术发展以来，这种微小的无病毒组织才可以培养利用。组织培养技术发展以来，这种微小的无病毒组织才可以培养利用。（1 1）茎尖培养脱毒的方法）茎尖培养脱毒的方法 茎尖培养脱毒一般包括以下几个步骤：茎尖培养脱毒一般包括以下几个步骤：培养基的选择和制备；培养基的选择和制备；待脱毒材料的消毒；待脱毒材料的消毒；茎尖的剥离、茎尖的剥离、接种和培养；接种和培养；诱导芽分化和小植株的增殖；诱导芽分化和小植株的增殖；诱导生根和移栽。诱导生根和移栽。（2 2）影响微茎尖培养脱毒的因素）影响微茎尖培养脱毒的因素 外植体大小外植体大小 外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，成活率外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，成活率越大，而茎尖越小，脱毒效果越好，叶原基的存在与否也影越大，而茎尖越小，脱毒效果越好，叶原基的存在与否也影响分生组织的分化能力，因为叶原基能提供生长素和细胞分响分生组织的分化能力，因为叶原基能提供生长素和细胞分裂素，这样可迅速形成双极性两端。裂素，这样可迅速形成双极性两端。因此，在采用茎尖培养脱毒时，要兼顾脱毒率、成活率及茎因此，在采用茎尖培养脱毒时，要兼顾脱毒率、成活率及茎尖发育成完整植株的能力。茎尖应以大到足以脱毒、小到足尖发育成完整植株的能力。茎尖应以大到足以脱毒、小到足以发育成完整植株为前提，一般切取长度为以发育成完整植株为前提，一般切取长度为0.20.20.5mm0.5mm、带、带有有1-21-2个叶原基的茎尖作为培养材料。个叶原基的茎尖作为培养材料。百合茎尖剥离百合茎尖剥离培养一周后培养一周后培养三周后培养三周后芽增殖芽增殖培养条件：光培养的效果通常比暗培养好。培养条件：光培养的效果通常比暗培养好。外植体的生理状态外植体的生理状态 选择活跃生长的芽，培养顶芽茎尖比选择活跃生长的芽，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。培养腋芽茎尖效果好。取芽的时间取芽的时间 一般选作萌动期较好。一般选作萌动期较好。茎尖培养的生长可能有四种类型茎尖培养的生长可能有四种类型:（1 1）组织不增大）组织不增大,不久变褐死亡不久变褐死亡-可能是生长点受到损伤所可能是生长点受到损伤所致致;(2(2）组织逐渐变绿）组织逐渐变绿,但体积增大缓慢但体积增大缓慢-可把组织转到可把组织转到NAANAA浓度浓度高于高于0.05mgL0.05mgL-1-1的培养基上的培养基上,并提高温度以加速生长。并提高温度以加速生长。(3)(3)组织基部不产生或少产生愈伤组织组织基部不产生或少产生愈伤组织,生长点发育正常生长点发育正常,一个月一个月可形成无根的小植株可形成无根的小植株-最理想的情况最理想的情况-当长有当长有2323片小叶片小叶时时,应转移到无生长素的培养基上促进生根。应转移到无生长素的培养基上促进生根。(4)(4)茎尖基部产生大量的愈伤组织茎尖基部产生大量的愈伤组织,而生长点很少生长而生长点很少生长-不理想不理想-把愈伤组织转移到无生长素的培养基上把愈伤组织转移到无生长素的培养基上,并降低培养温度并降低培养温度,以以抑制愈伤组织的生长抑制愈伤组织的生长,促进其分化。促进其分化。2 2、愈伤组织培养脱毒、愈伤组织培养脱毒 通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织。织。然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，到无病毒苗。感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，仅有仅有40%40%的单个细胞含有病毒，即愈伤组织无病毒植株。的单个细胞含有病毒，即愈伤组织无病毒植株。3 3 茎尖微体嫁接茎尖微体嫁接 微体嫁接是组织培养与嫁接技术相结合而获得无病毒微体嫁接是组织培养与嫁接技术相结合而获得无病毒种苗的一种方法。微体嫁接脱毒是在无菌条件下，将切取的种苗的一种方法。微体嫁接脱毒是在无菌条件下，将切取的茎尖（未感染病毒病的植株）嫁接到试管中培养的砧木苗茎尖（未感染病毒病的植株）嫁接到试管中培养的砧木苗（或实生苗）上，待其愈合发育为完整植株而达到脱毒的效（或实生苗）上，待其愈合发育为完整植株而达到脱毒的效果（木本植物茎尖培养难以生根成植株）。果（木本植物茎尖培养难以生根成植株）。病芽嫁接病芽嫁接热处理热处理嫩芽嫁接嫩芽嫁接鉴定获得无病毒苗鉴定获得无病毒苗4 4花药培养脱毒花药培养脱毒 花药培养的初衷本是获得单倍体，但由花药培养可以产花药培养的初衷本是获得单倍体，但由花药培养可以产生脱毒植株。后来的很多研究证实了这项发现，并且表明，生脱毒植株。后来的很多研究证实了这项发现，并且表明，草莓花药经愈伤组织培养产生的再生植株不仅脱毒率可高达草莓花药经愈伤组织培养产生的再生植株不仅脱毒率可高达85%85%以上，而且其中有以上，而且其中有95%95%以上都是能开花结果的二倍体。以上都是能开花结果的二倍体。5 5珠心胚培养脱毒珠心胚培养脱毒 柑橘、芒果等多胚植物的珠心细胞很容易形成珠心柑橘、芒果等多胚植物的珠心细胞很容易形成珠心胚。由于珠心细胞与维管束系统无直接联系，而病毒通常是胚。由于珠心细胞与维管束系统无直接联系，而病毒通常是通过维管束的韧皮组织传递的，因此，珠心组织往往是不带通过维管束的韧皮组织传递的，因此，珠心组织往往是不带病毒的。通过珠心胚培养可以获得无病毒植株。病毒的。通过珠心胚培养可以获得无病毒植株。三、脱毒苗的鉴定三、脱毒苗的鉴定 通过不同途径脱毒处理所获得的材料必须经过严格的病通过不同途径脱毒处理所获得的材料必须经过严格的病毒检测和农艺性状鉴定证明确实是无病毒存在、又是农艺性毒检测和农艺性状鉴定证明确实是无病毒存在、又是农艺性状优良的株系才能作为无病毒种源在生产上应用。状优良的株系才能作为无病毒种源在生产上应用。（一）脱毒苗的鉴定方法：（一）脱毒苗的鉴定方法：1 1直观测定法直观测定法-直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状特征是一种最简便的方法。特征是一种最简便的方法。2 2指示植物法指示植物法-用病毒在其他植物上出现的病毒特征作为用病毒在其他植物上出现的病毒特征作为鉴别病毒种类的标准，这种专用易产生病毒症状特征的寄主即鉴别病毒种类的标准，这种专用易产生病毒症状特征的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主（荆芥、千日红和各种烟草）。为指示植物，又称鉴别寄主（荆芥、千日红和各种烟草）。苹果褪绿叶斑病指示植物苹果褪绿叶斑病指示植物西方烟（叶雏缩）西方烟（叶雏缩）苋色藜（坏死斑）苋色藜（坏死斑）葡萄卷叶病指示植物葡萄卷叶病指示植物丽株丽株叶片反卷、红叶叶片反卷、红叶3 3、抗血清鉴定法、抗血清鉴定法 植物病毒是由核酸与蛋白质组成的核蛋白，可作为一种抗原，植物病毒是由核酸与蛋白质组成的核蛋白，可作为一种抗原，注射到动物体内即产生抗体。抗体存在于血清之中称为抗血清。注射到动物体内即产生抗体。抗体存在于血清之中称为抗血清。不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，用已知病毒的抗血清不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒，这种抗血清就成为高度专一性的试剂，特异性来鉴定未知病毒，这种抗血清就成为高度专一性的试剂，特异性高，是目前快速定量测定病毒的常规诊断。高，是目前快速定量测定病毒的常规诊断。4 4、电子显微镜检查法、电子显微镜检查法 人的眼睛不能观察小于人的眼睛不能观察小于0.1mm0.1mm的微粒，借助于普通光的微粒，借助于普通光学显微镜也只能看到小至学显微镜也只能看到小至200200微米的微粒，只有通过电子显微米的微粒，只有通过电子显微镜才能分辨微镜才能分辨0.5m0.5m大小的病毒颗粒。大小的病毒颗粒。采用电子显微镜可采用电子显微镜可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并可得知病毒颗粒以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并可得知病毒颗粒的大小、的大小、形状和结构，借以鉴定病毒的种类。形状和结构，借以鉴定病毒的种类。5 5、酶联免疫法、酶联免疫法 是采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。是采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定将抗原固定在支持物上，加入待检血清，在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。度较高和常使用的方法。6 6、PCRPCR检测法检测法（二）脱毒苗性状的鉴定（二）脱毒苗性状的鉴定 通过脱毒处理获得的无病毒材料，尤其是通过热处理和愈伤通过脱毒处理获得的无病毒材料，尤其是通过热处理和愈伤组织诱导获得的无病毒材料有可能产生变异。因此，获得无病组织诱导获得的无病毒材料有可能产生变异。因此，获得无病毒材料后，必须在隔离的条件下对其性状进行鉴定，要确保无毒材料后，必须在隔离的条件下对其性状进行鉴定，要确保无病毒苗的经济性状与原亲本的性状一致。病毒苗的经济性状与原亲本的性状一致。（三）无病毒原种的保存和应用（三）无病毒原种的保存和应用1 1、无病毒原种的保存、无病毒原种的保存 经过脱毒的无病毒植株并不抗病毒病，当病毒侵染时又经过脱毒的无病毒植株并不抗病毒病，当病毒侵染时又会被重新感染。无病毒原种的获得极不容易，必须在隔离条会被重新感染。无病毒原种的获得极不容易，必须在隔离条件下慎重保存，以免发生病毒再次感染。件下慎重保存，以免发生病毒再次感染。2 2、无病毒原种的应用、无病毒原种的应用无病毒原种的繁育无病毒原种的繁育 无病毒原种的繁育目前还没有一套完善的无病毒原种的繁育目前还没有一套完善的制度，一般都参照普通良种繁育制度进行，只是在繁育过程中加制度，一般都参照普通良种繁育制度进行，只是在繁育过程中加强隔离、消毒等，严防病毒的再次感染。强隔离、消毒等，严防病毒的再次感染。无病毒原种的推广无病毒原种的推广 无病毒原种种苗的推广应在发展良种的新无病毒原种种苗的推广应在发展良种的新区进行才能取得较好的效果。如在老区、尤其是病区使用，则应区进行才能取得较好的效果。如在老区、尤其是病区使用，则应实行统一的防治措施，一次性全区换种才能取得应有的效果。实行统一的防治措施，一次性全区换种才能取得应有的效果。