第54课时 血红蛋白的提取和分离(第2课时)通案.doc

北大附中河南分校高二生物教学通案课题：课题3 血红蛋白的提取和分离（第2课时）领导签字：时间： 13年 6月 6日 序号：54备课人：楚素霞教学目标：1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理3.体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤课题重点凝胶色谱法的原理和方法课题难点样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填教学活动一、情景导入（1分钟） 上节课我们学习了血红蛋白的提取和分离的“基础知识”部分，这节课我们继续学习血红蛋白的提取和分离的“实验设计”。二、自主预习（8分钟）并完成下列填空：红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。6凝胶色谱操作第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 。三、教师精讲（10分钟）2实验设计2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？2.2选择实验材料（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：血液由 和 两部分组成。血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？红细胞的洗涤过程为血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min×10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。思考：为何使用pH7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤粗分离（凝胶色谱操作）。2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。根据教材图519，说出制作色谱柱需要的材料。橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞安装色谱柱下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：色谱柱的装填过程。步骤操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀凝胶颗粒洗脱液沸水浴装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h样品加入和洗脱。其基本过程是：调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。补充备注2.1样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。2.2哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高2.3除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。2.4透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。四、合作交流（6分钟）普通班独立完成、教师集体讲评；宏志班独立完成、小老师讲解1与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义是什么？2.你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？五、典例分析(5分钟)例1：红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成。我们可以选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：（1）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。其中加入柠檬酸钠的目的是_。此过程即是样品处理，它应包括红细胞洗涤、_、分离血红蛋白溶液。洗涤红细胞的目的是_。来源:学,科,网（2）收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。来源:学,科,网Z,X,X,K透析的目的是_。透析的原理是_。（3）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电脉进行纯度鉴定。其中通过凝胶色谱法将样品纯化的目的是_。【解析】（1）柠檬酸钠是一种抗凝剂，加入柠檬酸钠可以防止血液凝固；样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液；洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。（2）透析袋一般是用硝酸纤维素制成的，透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中分子量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液。（3）凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，因此通过凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质。【答案】（1）防止血液凝固 血红蛋白的释放 去除杂蛋白 （2）去除相对分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内 （3）通过凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质六、当堂检测（15分钟）学生当堂完成,小组长负责检查,教师组织讲评普通班独立完成1-5题、教师集体讲评；宏志班独立完成1-5题、小老师讲解1洗涤红细胞的目的是 ( )A去除血清 B去除杂蛋白 C除去血小板 D除去水2制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是 ( )A移液管头部5 cm B移液管尾部5 cm C移液管头部3 cm D移液管尾部3 cm3下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是 ( ) A先加入1 mL透析后的样品 B加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出C如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功D洗脱时可以用缓冲液也可以用清水4装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应 ( ) A先打开后关闭 B关闭 C先关闭后打开 D打开5血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是 ( )A磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C防止血红蛋白被02氧化 D让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能八、课堂反思血红蛋白的提取和分离（第2课时）参考答案合作交流：1,哺乳动物及人的成熟的红细胞呈双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。2.答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。当堂检测：1-5 BACDD_血红蛋白的提取和分离（第2课时）参考答案合作交流：1,哺乳动物及人的成熟的红细胞呈双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。2.答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。当堂检测：1-6 BACDD