质粒DNA的提取、纯化与鉴定.doc
石河子大学 生物化学实验 姓名：侯云鹏 专业：作物遗传育种 学号： 学院：农学院 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 侯云鹏 （石河子大学农学院，新疆 石河子 ）摘 要：采用碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA，然后对提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。结果表明碱裂解法提取的质粒DNA纯度和产量高，且重复性好，具有结果稳定的特点，达到了分子生物学的实验要求。关键词：质粒DNA；碱裂解法；琼脂糖凝胶电泳前言质粒是一类存在于细菌染色体之外，能够独立复制并稳定遗传表达的双链环状DNA分子。大小从1Kb至200Kb以上不等，且携带抗生素、耐重金属等重要性状的筛选基因，以超螺旋状态存在于寄主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中繁殖和表达，是分子生物学实验中常用的工具。质粒DNA这种基因运载工具在分子生物学中有着极为广泛的应用前景，而质粒DNA的提取、纯化与鉴定是分子生物学实验中经常使用的最基本的工作。质粒DNA的提取效率和纯度直接影响到分子生物学实验的成功与否，比如酶切、连接、大肠杆菌的转化、PCR扩增等。从细菌中分离质粒DNA的方法一般包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前，分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验采用碱裂解法提取质粒DNA，并用琼脂糖凝胶电泳分析。1材料与方法1.1实验材料 含有pUC19质粒的大肠杆菌1.2实验仪器 恒温培养箱、恒温摇床、高速离心机、漩涡振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、微量加样器、烧杯、量筒、玻璃杯、微波炉、天平、电泳梳子、电泳槽、电泳器、紫外灯、1.3实验试剂溶液：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCL （pH8.0） 、10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0、高压蒸汽灭菌20min后，4保存。溶液：0.4mol/L NaOH、2%SDS（用时等体积混合，现配现用），注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。溶液：60mL 5mol/L KAc 、11.5ml冰醋酸、28.5mLH2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）。TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCL（pH8.0）、1 mmol/L EDTA（pH8.0）。氯仿： 异戊醇（24:1） 将量取加入24ml 氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4保存。LB培养基（1000ml）：每升含胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 15g，琼脂粉（固体培养基时用） 15g，用10M NaOH调pH为7.0，高压灭菌20min后，4保存。70%乙醇琼脂糖1L 5×TBE备用溶液：54g Tris，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA ，调pH 8.0。6×加样缓冲液：0.25% 溴酚蓝、40%蔗糖。其它试剂有：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Goldview 试剂。1.4实验方法1.4.1质粒DNA的提取取1.4 ml 含pUC19的大肠杆菌培养物于1.5ml 微量离心管中，6000r/min 离心2min，吸取上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥；加100 ul 溶液悬浮细菌沉淀，强烈振动以充分混和均匀，冰浴室温放置5min；加200 ul 溶液，盖紧管口，轻缓上下4-6次颠倒离心管以混合内容物，冰浴室温放置5min；加150 ml 溶液，盖紧离心管口后上下轻缓颠倒4-6次，置冰上10 min；12000 rpm离心10 min，转移上清液至另一离心管；向上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），反复混匀，12000 rpm 离心10 min，取上清液移至另一离心管中；加2倍体积无水乙醇，震荡混匀，20冰箱静置10 min，12000 rpm离心5-10 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残留液除净。加1 ml 70%乙醇洗涤沉淀物，12000 rpm离心 5 min，弃去上清液，将沉淀在室温下晾干。沉淀加20 ul TE，反复吹打使质粒DNA充分溶解，20保存。1.4.2质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳制备1%琼脂糖凝胶：称取0.5g 琼脂糖，放入100mL 锥形瓶中，加入50mL 的0.5×TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为0.5琼脂糖凝胶液（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）；制胶器的安装：a.取多功能制胶器，洗净，晾干；b. 将多功能制胶器放置于一水平位置，选择12×6cm 制胶架，然后选择1.5mm 的梳子（最大加样量25l）；c. 将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中；将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内；加入0.5×电泳缓冲液至电泳槽中；加样:用移液枪缓慢将DNA 样品垂直加入加样孔直至开口下方；电泳：a.接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA 片段从负极向正极移动)。保持电压120V； b.当溴酚蓝染料移动到凝胶总长度一半处时，停止电泳；将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下进行DNA 电泳条带的观察，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。2. 结果与分析 由上图可知：碱裂解法提取的质粒DNA具有清晰的亮带，其DNA片段荧光较强，提取的质粒DNA绝大多数为超螺旋结构，样品较为纯净，且质粒DNA质量稳定，结果重复性好。但是在点样孔附近出现了比较清晰的条带，这是由于蛋白等杂质为除尽，影响了质粒DNA的迁移率。3.讨论 碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+和Mg2+螯和，抑制DNase的活性，溶液裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性 。因此如果实验中缺少了溶液，用LB 液体培养基代替之也可以，只要在短时间内完成质粒的提取即可。裂解细菌主要是溶液中的NaOH， 而不是SDS，所以叫碱裂解法，若只用SDS也能抽提得到少量质粒，这是因为SDS也是碱性的，但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外， NaOH若不是新配制的，可能会由于空气中的CO2与NaOH作用，减弱了其碱性。这一步操作要注意两点：一是，放置时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂。二是，混匀动作要轻柔，既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。加入溶液后，会有大量的沉淀生成，这是由于要SDS与蛋白质结合后，SDS与醋酸钾生成了PDS， PDS的溶解度要比SDS低的多,从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。若用醋酸钠代替醋酸钾,所得到的沉淀就会大大减少。参考文献 黄培堂译Sam brook, Russell编著. 分子克隆实验指南M. 第3版.北京:科学出版社, 2002. A Zhou, X Jiang·X Xu Improved alkaline lysismethod forrap id isolation of plasmid DNA J. Biotechniques , 1997,23 (4) : 592594. JT L iou, BH Shieh·SW Chen An imp roved alkaline lmethod forminip reparation of plasmid DNA J. Prep Biochem Biotechnol, 1999, 29 (1) : 4954. S Ehrt,D Schnapp inger. Isolation of plasmids from Ecoli byalkaline lysisJ. Methods MolBiol, 2003, 235: 7578.
