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生物工艺学课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望第一节第一节 菌种来源菌种来源 微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长二：工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特性要符合工艺要求一、工业生产常用的微生物*从自然界中分离出来就能被利用；对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。使用重组DNA技术改造的菌株目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产常用的微生物菌种来源菌种来源工业菌种种类？产物？由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类藻类（alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种；微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉细菌、酵母菌、霉细菌、酵母菌、霉细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。菌和放线菌。菌和放线菌。菌和放线菌。工业生产常用的细菌有工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics)醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter)棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium)短杆菌短杆菌(Brevibacterium)用于生产：用于生产：生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase）蛋白酶（蛋白酶（proteinase）乳酸乳酸(lactic acid)醋酸醋酸(acetic acid)氨基酸氨基酸(amino acid)肌苷酸肌苷酸(inosinic acid)细菌（bacteria）：属于单细胞原核生物（unicellular prokaryote），），以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。细胞生长时细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。1、常用的细菌、常用的细菌 大肠杆菌大肠杆菌 应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。乳酸杆菌乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作n n 乳杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸而命名。存在广泛。嗜酸性，最适ph5.56.0,ph3.04.5仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌的繁殖，乳酶生即由活的乳酸杆菌制成，可治疗消化及腹泻。酸牛奶中的乳酸杆菌也有抑制肠道致病菌的作用。龋齿活动状态与唾液乳酸液杆菌计数之间有明确的相互关系。n n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌n n应用：应用：-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取生产菌的亲株或制取5-5-核苷酸酶的菌种。核苷酸酶的菌种。枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。酵母菌（酵母菌（yeast）酵母菌为单细胞真核生物（unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两个细胞。如果子芽不如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。工业上用的酵母菌有：啤酒酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假、假丝酵母丝酵母(Candida)、类酵母、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。真真核核细细胞胞结结构构示示意意图图种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪啤酒酵啤酒酵母母红酵红酵母母啤酒酵母是啤酒生产上常用的典型的上面发酵酵母。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取细胞色素C、核酸、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A和三磷酸腺苷等。最常提到的酵母酿酒酵母（也称面包酵母）(Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在酦酵面包和馒头的过程中面团中会放出二氧化碳。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。如酿酒酵母作为重要的模式生物，也是遗传学和分子生物学的重要研究材料。面包酵母面包酵母含蛋白质50左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在现代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等食品的优良发酵剂和营养剂。低糖酵母发酵时，面团一般含糖量7左右，高糖酵母发酵时含糖量则为16。安琪酵母股份有限公司是专业生产面包酵母的公司，产品涵盖所有的面包酵母产品类型，安琪牌活性干酵母（低糖型、高糖型）出口全世界80多个国家 霉菌（霉菌（mould）霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungifungi)统称为霉菌。统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性境，大多数为好氧性(aerobiotic)aerobiotic)，多腐生，少多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。主。生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度即受遗传性的控制，又受环交错呈网状。菌丝的长度即受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。散生长，或呈菌丝团状生长。工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；产品产品产品产品：酶制剂（酶制剂（酶制剂（酶制剂（enzyme preparationenzyme preparation）、抗生素）、抗生素）、抗生素）、抗生素(antibiotic)(antibiotic)、有机酸（、有机酸（、有机酸（、有机酸（organic acidorganic acid）及甾体激素）及甾体激素）及甾体激素）及甾体激素（steroid hormonesteroid hormone）等。等。等。等。n n曲霉属曲霉属n n其中以其中以黄曲霉黄曲霉具有很强具有很强毒性毒性。绿色和黑色的具有。绿色和黑色的具有很强的很强的酶活性酶活性，在食品发酵中广泛用于制酱、，在食品发酵中广泛用于制酱、酿酿酒酒。现代发酵工业中用于生产。现代发酵工业中用于生产葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶、糖糖化酶化酶和和蛋白酶蛋白酶等等酶制剂酶制剂。其他。其他菌株菌株有：黄曲霉有：黄曲霉（A.flavusA.flavus），烟曲霉（），烟曲霉（A.fumigatusA.fumigatus），灰绿曲霉），灰绿曲霉（A.glaucusA.glaucus），），构巢曲霉构巢曲霉（A.niduransA.nidurans），），寄生曲寄生曲霉霉（A.parasiticusA.parasiticus），土曲霉（），土曲霉（A.terreusA.terreus）和杂色）和杂色曲霉（曲霉（A.versicolorA.versicolor）等。）等。n n应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：酱油、酱类（淀粉酶）n n产生黄曲霉毒素，不仅能引起禽畜中毒致死，亦有致癌作用。n n米曲霉米曲霉n n应用：应用：米曲霉是一类产米曲霉是一类产复合酶复合酶的的菌株菌株，除产蛋白，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、酶外，还可产淀粉酶、糖化酶糖化酶、纤维素酶纤维素酶、植酸植酸酶酶等。等。主要用于酿酒制曲和酱油制曲。主要用于酿酒制曲和酱油制曲。应用：生产甲义丁二酸 毛霉毛霉n n应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作。毛霉的用途很广，常出现在酒药中，豉等的制作。毛霉的用途很广，常出现在酒药中，能能糖化糖化淀粉并能生成少量淀粉并能生成少量乙醇乙醇，产生，产生蛋白酶蛋白酶，有，有分解分解大豆蛋白大豆蛋白的能力，我国多用来做的能力，我国多用来做豆腐乳豆腐乳、豆豆豉豉。许多毛霉能产生。许多毛霉能产生草酸草酸、乳酸乳酸、琥珀酸琥珀酸及及甘油甘油等，有的毛霉能产生等，有的毛霉能产生脂肪酶脂肪酶、果胶酶果胶酶、凝乳酶凝乳酶等。等。常用的毛霉主要有鲁氏毛霉和常用的毛霉主要有鲁氏毛霉和总状毛霉总状毛霉。n n根霉根霉n n种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉霉n n应用：酿酒应用：酿酒根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。黑根霉，也叫面包霉。黑根霉，也叫面包霉。常寄生在面包和日常食品上，或混杂于培养基中，瓜果蔬菜等在运输和贮藏中的腐烂及甘薯的软腐都与其有关，菌丝体分泌出果胶酶，分解寄主的细胞壁，感染部位很快会腐烂形成黑斑。黑根霉(ATCC6227b)是目前发酵工业上常使用的微生物菌种。青霉菌青霉菌有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素，药用青霉素又称盘尼西林。灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶 放线菌放线菌(Actinomycetes)放线菌因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。种类：种类：种类：种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌霉素链霉菌应用：应用：应用：应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素。今年发现一些抗肿瘤抗病毒的抗生素。还是氨基素。今年发现一些抗肿瘤抗病毒的抗生素。还是氨基酸、维生素、酶和酶的抑制剂酸、维生素、酶和酶的抑制剂/除草剂除草剂/抗寄生虫等药抗寄生虫等药物的重要来源。物的重要来源。在液体沉没培养中由于搅拌器在液体沉没培养中由于搅拌器（agitatoragitator）的剪应力作用，常常形成短的分的剪应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它的最大经济价值在于能产生多团状生长。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素（种抗生素（antibioticsantibiotics）。）。）。）。从微生物中发现的从微生物中发现的抗生素，有抗生素，有60%60%以上是放线菌产生的，如链以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。常用的放线菌主要来自以下几个属：链常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。放线菌的分离放线菌的分离n n土样的采取？n n 游动放线菌n n小单孢菌n n嗜热放线菌n n嗜盐放线菌 其他生物：其他生物：A:担子菌（担子菌（Basidiomycetes）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。B：病毒：病毒(virus)其特点如下：1.形体微小，体积比细菌小的多。2.没有细胞结构，是一种独特分子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。3.营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）噬菌体（phage）是病毒的一种。：烈性噬菌体和温和噬菌：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。体概念与区别。噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。C：藻类（：藻类（alga）：培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。藻藻 类类 工工 厂厂放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节 已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成和异亮氨酸的合成调节机制调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术.(二)真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)q 生长迅速，营养要求不高，易培养；q 安全性好；q 比哺乳动物细胞操作简单；q 具有一定的修饰蛋白的能力。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第三节 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标：在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标：（1 1）菌种的营养特征：菌种的营养特征：（2 2）菌种的生长温度：菌种的生长温度：（3 3）菌种对所采用的设备及生产过程的适应性：菌种对所采用的设备及生产过程的适应性：（4 4）菌种的稳定性：菌种的稳定性：（5 5）产物的得率和产物的浓度：产物的得率和产物的浓度：（6 6）产物容易回收：产物容易回收：能满足（能满足（3 3）（6 6），则有希望成为效益较高的生产菌种。），则有希望成为效益较高的生产菌种。二、采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源q 结合产品的特点q 标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法n n分解纤维素的细菌的分离n n分解醛肟的细菌的分离 四、菌落的选出q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观观上就可以初步识别。上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落第二节第二节 生物活性物质的筛选生物活性物质的筛选降降血脂血脂活性的化合物的筛选活性的化合物的筛选抗动脉粥样硬化药物抗动脉粥样硬化药物血浆中的血浆中的胆固醇胆固醇胆固醇胆固醇来源有外源性和内源性两种途径。来源有外源性和内源性两种途径。外源性胆固醇主要来自外源性胆固醇主要来自食物食物，可通过调节，可通过调节食物结食物结食物结食物结构构构构来控制摄入量；内源性的则在来控制摄入量；内源性的则在肝脏肝脏肝脏肝脏中合成。在中合成。在肝细胞肝细胞肝细胞肝细胞的的细胞质细胞质细胞质细胞质中，由中，由乙酸乙酸经经2626步步生物合成生物合成生物合成生物合成步骤步骤合成内源性胆固醇。合成内源性胆固醇。1.降血脂药（降血脂药（Lipid-lowering drugs）（1 1）影响胆固醇合成影响胆固醇合成:HMG-CoA还原酶抑制剂还原酶抑制剂 洛伐他汀（洛伐他汀（lovastatin）、辛伐他汀、辛伐他汀(sinvatatin)（2）影响胆固醇吸收和转化影响胆固醇吸收和转化:胆汁酸结合树脂胆汁酸结合树脂 考来烯胺考来烯胺(colestyramine)（3）影响脂蛋白合成、转运及分解影响脂蛋白合成、转运及分解：苯氧酸类苯氧酸类:氯贝特氯贝特(clofibrate),吉非贝齐吉非贝齐(gemfibrozil)烟酸类：烟酸类：烟酸烟酸(nicotinic acid)3.3.多不饱和脂肪酸类：多不饱和脂肪酸类：亚油酸等亚油酸等 4.4.保护动脉内皮药：保护动脉内皮药：硫酸软骨素硫酸软骨素A A 2.2.抗氧化药：抗氧化药：普罗布考（普罗布考（probucolprobucol）HMG-CoA 还原酶抑制药：还原酶抑制药：n n3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMGCoA）还原酶抑制药，又称为他汀类药（statins），从霉菌培养液中提取，用于临床的有洛伐他汀（lovastatin）、普伐他汀（pravastatin）、辛伐他汀（simvastatin）以及人工合成的氟伐他汀（fluvastatin）、阿伐他汀（atorvastatin）等n nHMG-CoA HMG-CoA 还原酶是合成胆固醇的限速酶，他汀类结构与还原酶是合成胆固醇的限速酶，他汀类结构与HMG-CoAHMG-CoA相似，对酶的亲和力比相似，对酶的亲和力比HMG-CoA HMG-CoA 高高10,000 10,000 倍，倍，因此能在肝脏竞争抑制因此能在肝脏竞争抑制HMG-CoA HMG-CoA 还原酶，还原酶，从而阻碍内源从而阻碍内源性胆固醇的合成，降低血浆总胆固醇水平性胆固醇的合成，降低血浆总胆固醇水平 。洛伐他汀洛伐他汀（lovastatin）【不良反应不良反应】1.胃肠道反应、头痛或皮疹。胃肠道反应、头痛或皮疹。2.转氨酶升高转氨酶升高用药后用药后1 6个月检测肝功能。个月检测肝功能。3.骨骼肌溶解症骨骼肌溶解症:肌痛、肌球蛋白尿、肾功能肌痛、肌球蛋白尿、肾功能衰竭，在合用免疫抑制剂环孢素或降血脂药衰竭，在合用免疫抑制剂环孢素或降血脂药烟酸、吉非贝齐时较易发生。烟酸、吉非贝齐时较易发生。4.孕妇及哺乳妇女禁用。孕妇及哺乳妇女禁用。降血脂药物降血脂药物n n胆酸整合剂 n nHMGCoA还原酶抑制剂 n n烟酸及其衍生物 n n贝特类Fibrates n n普罗布考Probucoln n泛硫乙胺(Pantethine)n n弹性酶弹性酶(Elastase)n nOmega3脂肪酸脂肪酸。Molecular drug designn n 创制新药的四要素n n 生物靶标的选择生物靶标的选择n n 检测模型的确定检测模型的确定n n 先导化合物的发现先导化合物的发现n n 先导化合物的优化先导化合物的优化Molecular drug designn n药物分子设计由多学科相互穿插，交替进行药物设计学药物设计学分子生物学分子生物学结构生物学结构生物学基因组基因组生物信息学生物信息学数学数学统计学统计学药物化学药物化学有机药物化学有机药物化学计算机科学计算机科学计算化学计算化学分子药理学分子药理学一般药理学一般药理学 Introductionn n新药研发 R&D of New Drugsn n新药新药n n新药研发过程新药研发过程n n新药研发涉及学科新药研发涉及学科n n新药研发特点新药研发特点n n药物分子设计 Molecular Drug Designn n概念及内容概念及内容n n先导化合物 Lead Compound先导化合物先导化合物 Lead compoundn n简称先导物（Lead），是指新发现的对某种靶标和模型呈现明确药理活性的化合物。n n应与 hit 相区别Lead compoundsn nA lead is a representative of a compound series with sufficient potential(as measured by potency,selectivity,pharmacokinetics,physicochemical properties,novelty,and absence of toxicity)to progress to a full drug development program.药物分子设计的策略基础药物分子设计的策略基础n n分子的多样性、互补性和相似性构成了设计方分子的多样性、互补性和相似性构成了设计方法的策略基础法的策略基础n n分子的分子的多样性（多样性（diversitydiversity）是先导物发现的物质基础是先导物发现的物质基础n n分子的分子的互补性（互补性（complementaritycomplementarity）是分子识别和受体是分子识别和受体-配体结合的基础和推动力配体结合的基础和推动力n n分子的分子的相似性（相似性（similaritysimilarity）在不同的层次上有不同的在不同的层次上有不同的含义含义先导物发现先导物发现先导物优化先导物优化互补性互补性相似性相似性多样性多样性包容性包容性反相似性反相似性不相似性不相似性Lead discoveryn n分子的多样性分子的多样性n n天然生物活性物质天然生物活性物质n n组合化学组合化学n n组合生物合成和组合生物催化组合生物合成和组合生物催化n n基于临床副作用观察产生先导物基于临床副作用观察产生先导物n n虚拟筛选虚拟筛选n n分子的互补性分子的互补性n n基于生物大分子结构和作用机理的药物分子设计基于生物大分子结构和作用机理的药物分子设计n n反义寡核苷酸反义寡核苷酸Lead discovery and optimizationn n分子的相似性n n基于内源性配体分子的药物设计基于内源性配体分子的药物设计n n过渡态类似物过渡态类似物n n肽模拟物肽模拟物n n生物电子等排置换生物电子等排置换n n类似物变换类似物变换n n药物合成的中间体药物合成的中间体n n基于代谢转化基于代谢转化天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n 天然生物活性物质来源广泛n n 植物植物n n 动物动物n n 微生物微生物n n 海洋生物海洋生物n n 矿物矿物天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n 天然生物活性物质的特点n n 新颖的结构类型（分子多样性）新颖的结构类型（分子多样性）n n 独特的药理活性独特的药理活性n n 资源有限及地域性差异资源有限及地域性差异n n 有效成分含量很低有效成分含量很低n n 大多数结构复杂，作用强度不同大多数结构复杂，作用强度不同天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n青蒿素青蒿素青蒿素Artemisinin黄花蒿黄花蒿Artemisia annula蒿甲醚蒿甲醚Artemether生物利用度较低生物利用度较低复发率高复发率高天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n喜树碱羟基喜树碱羟基喜树碱Hydroxycamptothecin喜树喜树Camptotheca acuminata拓扑替康拓扑替康Topotecan水溶性较差，毒性大水溶性较差，毒性大天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n紫杉醇紫杉醇紫杉醇Taxol红豆杉红豆杉Taxus紫杉特尔紫杉特尔Taxotere紫杉特尔紫杉特尔n n与紫杉醇相比，紫杉特尔的水溶性较大，毒性较与紫杉醇相比，紫杉特尔的水溶性较大，毒性较小，但疗效相当。已由法国小，但疗效相当。已由法国RhonePoulencRoreRhonePoulencRore公司公司生产，美国生产，美国FDAFDA于于19961996年批准上市，以多乙氧基年批准上市，以多乙氧基醚（醚（polysorbate-80polysorbate-80）助溶制成针剂，用于治疗乳）助溶制成针剂，用于治疗乳腺癌，特别是当化疗失败后可再用它治疗。紫杉腺癌，特别是当化疗失败后可再用它治疗。紫杉特尔在敏感细胞中抑制微血管解聚的作用为特尔在敏感细胞中抑制微血管解聚的作用为paclitaxel paclitaxel 的的2 2倍，在动物和人癌细胞株中的杀伤作倍，在动物和人癌细胞株中的杀伤作用为用为paclitaxelpaclitaxel的的1.3121.312倍，并且对倍，并且对paclitaxelpaclitaxel耐药的耐药的细胞的活性比细胞的活性比paclitaxelpaclitaxel强数倍。自强数倍。自19901990年在欧洲开年在欧洲开始临床研究以来，已在欧美，日本和我国完成始临床研究以来，已在欧美，日本和我国完成期临床实验。初步观察对乳腺癌、卵巢癌、肺癌期临床实验。初步观察对乳腺癌、卵巢癌、肺癌均有效，是一受到广泛重视的新药均有效，是一受到广泛重视的新药 天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n局麻药可卡因可卡因Cocaine南美洲古柯南美洲古柯Erythroxylum coca Lam普鲁卡因普鲁卡因Procaine天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n抗生素类天然抗生素天然抗生素微生物培养液微生物培养液半合成抗生素半合成抗生素天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n他汀类降脂药美伐他汀美伐他汀Mevastatin洛伐他汀洛伐他汀 Lovastatin辛伐他汀辛伐他汀Simvastatin普伐他汀普伐他汀Pravastatin桔青霉菌等桔青霉菌等Penicillium citrinum氟伐他汀氟伐他汀Fluvastatin氟伐他汀氟伐他汀n n完全经化学合成的完全经化学合成的3 3羟基羟基3 3甲基戊二酰辅酶甲基戊二酰辅酶A(HMGA(HMGCoA)CoA)还原酶抑制剂类降血脂新药，与还原酶抑制剂类降血脂新药，与普伐他汀普伐他汀类似，其无需代谢转化而直接具有药理类似，其无需代谢转化而直接具有药理活性。本品氟苯吲哚部分仿拟辅酶，能与活性。本品氟苯吲哚部分仿拟辅酶，能与HMGHMGCoACoA还原酶相互作用，竞争性抑制这一催化还原酶相互作用，竞争性抑制这一催化HMGHMGCoACoA转化为甲羟戊酸的胆固醇生物合成限转化为甲羟戊酸的胆固醇生物合成限速酶，减少细胞内胆固醇贮量，增加低密度脂蛋速酶，减少细胞内胆固醇贮量，增加低密度脂蛋白的胆固醇白的胆固醇(LDL(LDLC)C)受体数量，恢复细胞内胆固受体数量，恢复细胞内胆固醇代谢稳态，并加速从血浆中清除醇代谢稳态，并加速从血浆中清除LDLLDLC C。本品。本品为右旋为右旋(强活性强活性)和左旋和左旋(弱活性弱活性)组成的消旋体，前组成的消旋体，前者活性强者活性强3030倍。倍。天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n动物毒素n n蛇毒蛇毒BungarotoxinBungarotoxin，NN2 2受体拮抗剂受体拮抗剂肌松药肌松药n n蛇毒蛇毒BatroxobinBatroxobin，溶血栓酶，溶血栓酶抗栓药抗栓药n n鱼毒鱼毒TetrodotoxinTetrodotoxin，钠通道阻断剂，钠通道阻断剂心血管药物心血管药物n n蜂毒蜂毒ApaminApamin，钙通道阻断剂和钾通道开放剂，钙通道阻断剂和钾通道开放剂心血管药物心血管药物组合化学组合化学Combinatorial chemistryn n同时制备含众多分子的化合物库n n以代数级数增加构建块的数目，库容量则以几以代数级数增加构建块的数目，库容量则以几何级数增加何级数增加n n与高通量筛选（high-throughput screening,HTS）技术结合，可极大地加快先导物发现和优化的速度组合合成组合合成Combinatorial synthesisn n平行合成和混分合成n n固相合成和液相合成n n小分子组合合成n n计算机辅助设计及虚拟库合成n n八学期选修课“组合化学与新药研究”组合生物合成组合生物合成Combinatorial biosynthesisn n基本原理基因变异（混合、匹配、交换、突变等）基因变异（混合、匹配、交换、突变等）基因克隆基因克隆多种变异的酶系多种变异的酶系多种非天然的天然物质多种非天然的天然物质聚酮合酶催化合成红霉素聚酮合酶催化合成红霉素组合生物催化组合生物催化Combinatorial biocatalysisn n基本原理变异酶系或微生物酶系变异酶系或微生物酶系催化小分子化合物转化催化小分子化合物转化多种人工的天然化合物多种人工的天然化合物岩白菜内酯的生物催化组合库岩白菜内酯的生物催化组合库 基于临床副作用观察产生的先导物基于临床副作用观察产生的先导物n n 作用与作用与 作用的分离作用的分离异丙嗪的镇静作用异丙嗪的镇静作用 Promethazine异丙嗪（抗过敏药）异丙嗪（抗过敏药）Chlorpromazine氯丙嗪（安定）氯丙嗪（安定）Thiazinamium噻丙胺（支气管扩张）噻丙胺（支气管扩张）磺胺家族的发展磺胺家族的发展单氨氧化酶抑制剂的发现单氨氧化酶抑制剂的发现格鲁米特的芳构酶抑制作用格鲁米特的芳构酶抑制作用筛选发现先导物筛选发现先导物n n随机与非随机筛选 Random/nonrandom screening