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现代分子生物学第五章 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望重组重组DNADNA操作过程示意图操作过程示意图Gregor Mendel(1822-1884).The Father of Genetics现现代代分分子子生生物物学学的的快快速速发发展展，得得益益于于上上个个世世纪纪中中叶叶以以来来研研究究方方法法、特特别别是是基基因因操操作作和和基基因工程技术的进步。因工程技术的进步。基基因因操操作作主主要要包包括括DNA分分子子的的切切割割与与连连接接、杂杂交交、电电泳泳、细细胞胞转转化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、表表达达、定定点点突突变变和和PCR扩扩增增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核酸操作行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核酸操作的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种寄主细胞中的繁衍与表达。一种寄主细胞中的繁衍与表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的生物细胞之中的能力，是物的基因置于新的生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。基因工程技术区别于其它技术的根本特征。DNA操作技术操作技术基因克隆的常用载体系统基因克隆的常用载体系统基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件三大成就：三大成就：一、在一、在2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是带者、即基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；质，解决了遗传的物质基础问题；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制型和半保留复制机制,解决了基因的自我复解决了基因的自我复制和世代交替问题；制和世代交替问题；三三、5050年年代代末末至至6060年年代代，相相继继提提出出了了“中中心心法法则则”和和操操纵纵子子学学说说,成成功功地地破破译译了了遗遗传传密密码码，阐阐明了遗传信息的流动与表达机制。明了遗传信息的流动与表达机制。表表5-15-1重组重组DNADNA技术史上的主要事件技术史上的主要事件年年 份份事事 件件1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶聚合酶I。1959-1960Ochoa发发 现现 RNA聚聚 合合 酶酶 和和 信信 使使 RNA，并并 证证 明明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破破译译了了第第一一个个遗遗传传密密码码；Jacob和和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和和Brenner等等人人证证明明，多多肽肽链链上上的的氨氨基基酸酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完完成成了了酵酵母母丙丙氨氨酸酸tRNA的的全全序序列列测测定定；科科学家证明细菌的抗药性通常由学家证明细菌的抗药性通常由“质粒质粒”DNA所决定。所决定。1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等等人人破破译译了了全全部部遗遗传传密密码。码。1967第一次发现第一次发现DNA连接酶连接酶1970Smith，Wilcox和和Kelley分分离离了了第第一一种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶，Temin和和Baltimore从从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等等人人发发展展了了DNA重重组组技技术术，于于72年年获获得得第第一个重组一个重组DNA分子，分子，73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与与Maxam和和Gilbert等等人人发发明明了了DNA序序列列测测定定技技术术，1977年完成了全长年完成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组测定。基因组测定。1978首首次次在在大大肠肠杆杆菌菌中中生生产产由由人人工工合合成成基基因因表表达达的的人人脑脑激激素素和和人人胰胰岛素。岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和和Brinster获获得得转转基基因因小小鼠鼠，Spradling和和Rubin得得到到转基因果蝇。转基因果蝇。1982美美、英英批批准准使使用用第第一一例例基基因因工工程程药药物物胰胰岛岛素素，Sanger等等人人完成了入噬菌体完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。1983获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。的专利。1986GMO首次在环境中释放。首次在环境中释放。1988Watson出任出任“人类基因组计划人类基因组计划”首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠公司获得转肿瘤基因小鼠“Oncomouse”。1992欧欧共共体体35个个实实验验室室联联合合完完成成酵酵母母第第三三染染色色体体全全序序列测定列测定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完完 成成 第第 一一 个个 高高 等等 植植 物物 拟拟 南南 芥芥 的的 全全 序序 列列 测测 定定（(1.15108bp)。2001完成第一个人类基因组全序列测定完成第一个人类基因组全序列测定(2.7109bp)。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶能能够够识识别别DNA上上的的特特定定碱碱基序列并从这个位点切开基序列并从这个位点切开DNA分子。分子。第第一一个个核核酸酸内内切切酶酶EcoRI是是Boyer实实验验室室在在1972年年发发现现的的，它它能能特特异异性性识识别别GAATTC序序列列，将将双双链链DNA分分子子在在这这个个位位点点切切开开并并产产生生具有粘性末端的小片段。具有粘性末端的小片段。图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 体体外外利利用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶和和DNA连连接接酶酶进进行行DNA的的切切割割和和重重组组以以后后，还还要要将将它它们们连连接接到到具具备备自自主主复复制制能能力力的的DNA分分子子上上，才才能能在在寄主细胞中进行繁殖。寄主细胞中进行繁殖。具具备备自自主主复复制制能能力力的的DNA分分子子就就是是分分子子克克隆隆的的载载体体（vector）。病病毒毒、噬噬菌菌体体和和质质粒粒等等小小分子量复制子都是基因导入的载体。分子量复制子都是基因导入的载体。获获得得了了用用外外源源DNA片片段段和和载载体体分分子子重重组组而而成成的的杂杂种种DNA分分子子后后，还还必必须须通通过过一一个个被被称称为为细细菌菌转转化化的的过过程程将将其其重重新新导导入入到到寄寄主主细细胞胞中中，才能保证重组才能保证重组DNA分子的增殖（图分子的增殖（图5-3）。）。图图5-3 重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 5.2 DNA操作技术操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自自 从从 琼琼 脂脂 糖糖（agarose）和和 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺（polyacrylamide）凝凝胶胶被被引引入入核核酸酸研研究究以以来来，按按分分子子量量大大小小分分离离DNA的的凝凝胶胶电电泳泳技技术术，已已经经发发展展成成为为一一种种分分析析鉴鉴定定重重组组DNA分分子子及及蛋蛋白白质质与核酸相互作用的重要实验手段。与核酸相互作用的重要实验手段。琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？基基 本本 原原 理理一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极，把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的迁迁移移率率。它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带的的净净电电荷荷数数成成正正比比，与片段大小成反比。与片段大小成反比。生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所以以，DNA和和RNA又又被被称称为为多多聚聚阴阴离离子子（polyanions），在在电电场场中中向向正正电电极极的的方向迁移。方向迁移。由由于于糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上的的重重复复性性质质，相相同同数数量量的的双双链链DNA几几乎乎具具有有等等量量的的净净电电荷荷（电电荷荷密密度度），因因此此它它们们能能以以同同样样的的速速度度向向正正电电极方向迁移。极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基个碱基对之间。对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强，度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强，越适越适合分离小分子量的分子。合分离小分子量的分子。表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501图图5-4 5-4 溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易易于于鉴定。鉴定。图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分分子导入宿主细胞中。外源子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。分离纯化出来。细菌转化（细菌转化（transformation），是指一种细菌菌），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状而导致性状特征发生遗传改变的过程。特征发生遗传改变的过程。为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（被称作感受态细胞（competent cells）。）。图图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 CaCl2法法将将快快速速生生长长期期大大肠肠杆杆菌菌置置于于经经0预预处处理理的的低低渗渗CaCl2溶溶液液中中，细细胞胞膨膨胀胀，膜膜通通透透性性改改变变，易与外源易与外源DNA相粘附。相粘附。将将该该体体系系转转移移到到42下下做做短短暂暂的的热热刺刺激激，外外源源DNA就就可可能能被被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后的的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转转化化效效率率可可达达到到51062107个个转转化化子子/g超超螺旋质粒螺旋质粒DNA。电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细进入细胞质。胞质。将将生生长长至至对对数数中中期期的的E.coli菌菌液液冷冷却却至至4后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%的的甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（21010/ml）置置于于特特制制的的电电极极杯杯中中进进行电击。行电击。获获 得得 最最 大大 转转 化化 效效 率率 时时 场场 强强 一一 般般 为为12.515kV/cm，时时间间跨跨度度一一般般为为4.55.5毫毫秒。秒。电电击击转转化化与与温温度度有有关关，一一般般在在04进进行行。由由于于转转化化载载体体上上常常带带有有LacZ基基因因，多多用用带带有有不不同同抗抗生生素素（常常用用的的抗抗生生素素包包括括氨氨苄苄青青霉霉素素、卡卡那那霉霉素素和和四四环环素素等等）的的选选择择性性培培养养基基结结合合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。利利用用噬噬菌菌体体颗颗粒粒能能够够有有效效地地将将DNA注注入入到到寄寄主主细细胞胞中中这这一一特特点点，科科学学家家又又发发明明了了重重组组体体DNA分子的体外包装法。分子的体外包装法。经经包包装装的的基基因因工工程程噬噬菌菌体体颗颗粒粒能能够够借借助助细细菌菌表表面面的的噬噬菌菌体体接接受受器器位位点点将将DNA注注入入受受体体细细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。图图5-6 噬菌体作为克隆载体构建基因文库的噬菌体作为克隆载体构建基因文库的流程图流程图 5.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚聚合合酶酶链链式式反反应应是是快快速速扩扩增增DNA序序列列最最常常用用的方法。的方法。PCR反反应应的的模模板板DNA若若是是基基因因组组上上的的某某个个片片段段，就就称称为为genomic PCR，若若是是mRNA，反反转录产生的转录产生的cDNA，就称为，就称为RT-PCR。PCR技术的原理技术的原理首首先先将将双双链链DNA分分子子在在临临近近沸沸点点的的温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNA分分子子，DNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中的的四四种种脱脱氧氧核苷三磷酸合成新生的核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。互补链。DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火）DNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经经不不断断重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间的的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。将将含含有有待待扩扩增增DNA样样品品的的反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（94）环环境境下下加加热热1分分钟钟，使使双双链链DNA变变性，形成单链模板性，形成单链模板DNA。降降低低反反应应温温度度（退退火火，约约50），约约1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNA结结合合在在靶靶DNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。将将反反应应混混合合物物的的温温度度上上升升到到72左左右右保保温温1-数数分分钟钟，在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物的的3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按53方向延伸，合成新生方向延伸，合成新生DNA互补链。互补链。图图5-16 聚聚合合酶酶链链式式反反应应示示意意图图。（a）起起始始材材料料，双双链链DNA；（b）反反应应混混合合物物加加热热后后发发生生链链分分离离，降降温温使使引引物物结结合合到到待待扩扩增增靶靶DNA区区段段两两 端端 的的 退退 火火 位位 点点 上上；（c）Taq聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模板板在在引引物物的的引引导导下下利利用用反反应应混混合合物物中中的的dNTPs合合成成互互补补的的新新链链DNA；（d）将将反反应应混混合合物物再再次次加加热热，使使旧旧链链和和新新链链分分开开；（e）合合成成新新的的互互补补链链DNA；（f）重重复复b；（；（g）重复）重复c、图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 图图5-8 PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DNA产产物物数数量的比较量的比较5.2.4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由由于于PCR敏敏感感性性高高，扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。90年年代代末末期期出出现现了了Q-PCR，利利用用荧荧光光检检测测PCR仪仪绘绘制制DNA扩扩增增过过程程中中的的累累积积速速率率动动态态变变化化图图，基基本本消消除除在在测测定定终终端端产物丰度时变异系数较大的问题。产物丰度时变异系数较大的问题。混混合合在在PCR反反应应液液中中的的荧荧光光探探针针只只有有与与大大片片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随随着着新新合合成成DNA片片段段的的增增加加，由由于于结结合合到到DNA上上的的荧荧光光探探针针增增加加，被被激激发发产产生生的的荧荧光光相应增加。相应增加。非非序序列列特特异异性性荧荧光光染染料料SYBR Green I,激激发发光波长光波长520nm。SYBR Green I作作探探针针的的实实时时定定量量PCR实实验验过程图示过程图示 为为确确保保荧荧光光检检测测的的确确实实是是靶靶DNA，又又设设计计了了仅能与目的仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。特异结合的荧光探针。TaqMan探探针针是是一一段段与与靶靶DNA序序列列中中间间部部位位结结合合的的单单链链DNA，长长50bp-150bp，该该DNA的的5和和3端端带带有有短短波波长长和和长长波波长长两两个个不不同同荧荧光光基基团团，由由于于彼彼此此距距离离靠靠近近，在在荧荧光光共共振振能能量量转转移移（FRET）作作用用下下发发生生荧荧光光淬淬灭灭，因因而检测不到荧光。而检测不到荧光。随随着着PCR反反应应的的进进行行，TaqMan 探探针针结结合合到到目目的的DNA序序列列上上，并并且且会会被被具具有有外外切切酶酶活活性性的的Taq DNA聚聚合合酶酶逐逐个个切切除除而而降降解解。切切下下来来的的荧荧光光基基团团解解除除了了荧荧光光淬淬灭灭的的束束缚缚，会会在在激激发发光光下下发发出出荧荧光光，因因此此，产产生生的的荧荧光光强强度度直直接反映了所扩增靶接反映了所扩增靶DNA的总量。的总量。TaqMan探探针针 实实 时时 定定量量 PCR技技术术 图图5-11用实时定量用实时定量PCR法分析未知样品靶基因法分析未知样品靶基因的绝对表达量。的绝对表达量。Ct值值是是产产物物荧荧光光强强度度首首次次超超过过设设定定阈阈值值时时，PCR反反应应所所需需的的循循环环数数。利利用用标标准准曲曲线线，可可以以确定样品中待检测靶确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建把把某某种种生生物物的的基基因因组组DNA切切成成适适当当大大小小，分分别别与与载载体体组组合合，导导入入微微生生物物细细胞胞，形形成成克克隆隆。汇汇集集包包含含基基因因组组中中所所有有DNA序序列列的的克克隆隆（理理论论上上每每个个序序列列至至少少有有一一个个代代表表），这这样样的的克克隆片段的总汇，称为基因组隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。文库。Clark和和Carbon于于1975年提出公式：年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式式中中：N表表示示一一个个基基因因组组文文库库所所应应该该包包含含的的重重组组克克隆隆数数目目；p表表示示所所期期望望的的靶靶基基因因在在文文库库中中出出现现的的概概率率；f表表示示重重组组克克隆隆平平均均插插入入片片段的长度与基因组段的长度与基因组DNA总长的比值。总长的比值。为为获获得得整整个个基基因因簇簇或或一一个个基基因因及及其其两两翼翼延延伸伸序序列列，基基因因组组文文库库中中的的DNA片片段段常常大大于于20kb。以以 人人 为为 例例，其其 基基 因因 组组 大大 小小 为为 3109bp若若p=99%，平平均均插插入入片片段段大大小小为为20kb，则则N=6.7105。构构建建基基因因组组文文库库最最常常用用的的是是噬噬菌菌体体载载体体（克克隆隆能能力力约约1520kb）和和限限制制性性内内切切酶酶部部分分消消化化法法。例例如如用用识识别别4个个核核苷苷酸酸的的核核酸酸限限制制性性内内切切酶酶Sau3A，与与BamHI是是一一对对同同尾尾酶酶消消化化DNA，由由Sau3A酶酶切切产产生生的的DNA片片段段可可插插入入到到经经BamHI消化的消化的噬菌体载体上。噬菌体载体上。图图5-13 用用Sau3A限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化真真核核生生物物基基因因组组DNA并并利利用用 噬噬菌菌体体载载体体构构建建基基因因组文库的过程图示。组文库的过程图示。此此外外，还还有有很很多多大大容容量量克克隆隆载载体体，如如柯柯斯斯质质粒粒、细细菌菌人人工工染染色色体体（BAC）、P1源源人人工工染染色色体体（PAC）、酵酵母母人人工工染染色色体体（YAC）等等都都可可用用于基因组文库的构建。于基因组文库的构建。它它们们的的优优点点是是可可以以插插入入更更大大片片段段DNA，但但是是稳稳定定性性一一般般较较差差，在在大大量量复复制制的的过过程程中中容容易易出出现现缺失现象。操作也相对较困难。缺失现象。操作也相对较困难。5.3 RNA基本操作技术基本操作技术真真核核生生物物基基因因组组DNA庞庞大大，有有大大量量重重复复序序列列，很很难难直直接接分分离离得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNA来来自自反反转转录录的的mRNA，无无冗冗余余序序列列，通通过过筛筛选选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。文库，可较快地分离到相关基因。细细胞胞中中的的总总RNA包包括括mRNA，rRNA，tRNA以以及及一一些些小小RNA（sRNA）。一一个个典典型型的的动动物物细细胞胞约约含含10-5g RNA,其其中中80%-85%为为rRNA、15%-20%为为tRNA及及sRNA，这这些些RNA分分子子具具有有确确定定的的大大小小和和核核苷苷酸酸序序列列，特特别别是是rRNA电电泳泳后后28S和和18S特特征征性性条条带带是是鉴鉴定定总总RNA纯纯度度和和完完整整性性的的重重要要参参数数。mRNA约约占占总总RNA 的的1%-5%。图图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯的分离纯化过程简图。化过程简图。RNA的的浓浓度度和和纯纯度度可可以以通通过过测测定定其其OD260和和OD280 来来 判判 断断。OD260为为 1时时 相相 当当 于于 浓浓 度度 为为40g/ml，而而OD260/OD280的的比比值值如如果果在在1.8-2.0之之间间，表表示示所所提提取取的的RNA纯纯度度较较好好，如如果果样样品品中中有有蛋蛋白白质质或或酚酚污污染染，则则OD260/OD280的的比比值值将明显低于将明显低于1.8。由由于于RNA分分子子敏敏感感脆脆弱弱，在在自自然然状状态态下下难难以以被被扩扩增增，为为了了研研究究mRNA所所包包含含的的功功能能基基因因信信息息，一一般般将将其其反反转转录录成成稳稳定定的的DNA双双螺螺旋旋（cDNA，complementary DNA），再再插插入入到到可可以以自自我复制的载体中。我复制的载体中。图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰因因为为绝绝大大多多数数大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞都都会会切切除除带带有有5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶的的外外源源DNA，所所以以实实验验中中常常选选用用mcrA-mcrB-菌株以防止菌株以防止cDNA被降解。被降解。cDNA文库的构建文库的构建cDNA的长度一般在的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用文库常用Uni-zap XR（一种（一种噬菌粒噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含有pBluescript载载体的全部序列。体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将）将cDNA插入片段转移到质粒系插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。统中进行筛选、克隆和序列分析。基因文库的筛选基因文库的筛选基基因因文文库库的的筛筛选选是是指指通通过过某某种种特特殊殊方方法法从从基基因因文文库库中中鉴鉴定定出出含含有有所所需需重重组组DNA分分子子的的特特定定克克隆隆的的过过程程。筛筛选选的的方方法法有有很很多多种种，如如核核酸杂交法，酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。1、核酸杂交法：、核酸杂交法：核核酸酸杂杂交交法法以以其其广广泛泛的的适适用用性性和和快快速速性性成成为为基基因因文文库库筛筛选选中中最最常常用用的的一一种种方方法法，用用放放射射性性标标记记的的特特异异DNA探探针针适适用用于于高高密密度度的的菌菌落落杂交筛选。杂交筛选。将将待待筛筛选选菌菌落落转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，适适当当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取取出出已已经经长长有有菌菌落落的的膜膜，用用碱碱液液处处理理，使使菌菌落落发发生生裂裂解解，DNA随随之之变变性性。用用蛋蛋白白酶酶K处处理理硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜去去除除蛋蛋白白质质，形形成成菌菌落落DNA的印迹。的印迹。80烘烘烤烤滤滤膜膜，将将DNA固固定定在在膜膜上上。将将滤滤膜膜与与放放射射性性标标记记的的DNA或或RNA探探针针杂杂交交，通通过过放放射射性性自自显显影影显显示示杂杂交交结结果果。通通过过对对应应于于平平板上的位置找到相应克隆。板上的位置找到相应克隆。图图 5-17 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图通过核酸杂交筛选目的克隆流程图2、PCR筛选法筛选法将将整整个个文文库库（以以质质粒粒的的形形式式或或者者细细菌菌的的形形式式均均可可）保保存存在在多多孔孔培培养养板板上上，用用设设计计好好的的目目的的基基因因探探针针对对每每个个孔孔进进行行PCR筛筛选选，鉴鉴定定出出阳阳性性的的孔孔，把把每每个个阳阳性性孔孔中中的的克克隆隆再再稀稀释释到到次次级级多多孔孔板板中中进进行行PCR筛筛选选。重重复复以以上上程程序序，直直到到鉴鉴定定出与目的基因对应的单个克隆为止。出与目的基因对应的单个克隆为止。3、免疫筛选法、免疫筛选法该该法法仅仅适适用用于于对对表表达达文文库库的的筛筛选选。若若实实验验中中靶靶基基因因的的序序列列完完全全未未知知但但是是有有针针对对该该基基因因产产物物的的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。图图5-18 噬噬菌菌体体表表达达文文库库的的免免疫疫化化学学筛筛选选法法示意示意图图 5.4 SNP的理论与应用的理论与应用SNP是是Single Nucleotide Polymorphism的的缩缩写写，即即单单核核苷苷酸酸多多态态性性，指指基基因因组组DNA序序列列中中由由于于单单个个核核苷苷酸酸（A，T，C和和G）的的突突变变而引起的多态性。而引起的多态性。5.4.1 SNP概述概述科科学学上上把把染染色色体体DNA同同一一位位置置上上的的每每个个碱碱基基类类型型叫叫做做一一个个等等位位位位点点。SNP是是基基因因组组中中最最简简单单最最常常见见的的多多态态性性形形式式，具具有有很很高高的的遗遗传传稳稳定定性性。SNP检检测测和和分分析析技技术术已已经经成成为为继继限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性（RFLP）和和微微卫卫星星标标记记（SSR）之之后的第三代遗传标记。后的第三代遗传标记。图5-19 5-19 染色体上共同染色体上共同遗传的的SNPSNP组合。合。图中图中SNP1和和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点有等位位点A和和G，SNP2有等位位点有等位位点G和和T。因。因此，染色体对有两种可能的此，染色体对有两种可能的SNP组合。组合。单倍倍型型基因基因型型外外显子子IV内含子内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较不同单倍型和基因型之间的多态性比较 据据估估计计，人人类类DNA中中每每300-1000个个碱碱基基对对就就有有一一个个SNP，因因此此，一一个个人人类类个个体体大大约约携携带带300万万-1000万万个个SNPs。位位于于染染色色体体上上某某一一区区域域的的一一组组相相关关联联的的SNP等等位位位位点点被被称称作作单单倍倍型型（haplotype），相相邻邻SNPs的的等等位位位位点点倾倾向于以一个整体遗传给后代。向于以一个整体遗传给后代。根据根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区），调控区SNP（pSNP）和非）和非编码区编码区SNP（rSNP）三类。）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义分为同义cSNP（synonymous cSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP），碱基序列的改变使氨），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。5.4.2 SNP的检测技术的检测技术通过通过DNA测序法获得新的测序法获得新的SNP。基基因因分分型型（genotyping）是是指指利利用用数数据据库库中中已已有有的的SNP进进行行特特定定人人群群的的序序列列和和发发生生频频率率的的研研究究，主主要要包包括括基基因因芯芯片片技技术术、Taqman技技术术、分分子子信信标标（molecular beacons）技技术术和焦磷酸测序法（和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。）等。1基因芯片技术基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。列杂交。优点是高通量，一次可对多个优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。单。缺点是芯片设计成本高。而且，由于缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样样品的复杂性，有些品的复杂性，有些SNP不能被检测。不能被检测。2Taqman技术技术PCR反反应应系系统统中中加加入入2种种不不同同荧荧光光标标记记的的分分别别与与两两个个等等位位基基因因配配对对的的探探针针。随随着着PCR的的进进行行，与与模模板板完完全全配配对对的的探探针针逐逐步步被被Taq DNA聚聚合合酶酶的的53外外切切活活性性所所切切割割，荧荧光光基基团团与与3端端的的淬淬灭灭基基团团分分离离，荧荧光光基基团团被被激激活活。不不完完全全配配对对的的探探针针（代代表表另另一一种种等等位位基基因因）不不能能被被有有效效切切割，供体荧光基团依然被淬灭。割，供体荧光基团依然被淬灭。3分子信标（分子信标（molecular beacon）技术）技术是是一一种种呈呈茎茎环环结结构构的的荧荧光光标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸，环环状状区区与与靶靶序序列列特特异异性性结结合合，茎茎干干区区由由5-8个个碱碱基基对对组组成成，5端端带带有有荧荧光光发发生生基基团团，3端端带带有有荧荧光光淬淬灭灭基基团团。自自由由状状态态时时，分分子子信信标标呈呈发发卡卡式式结结构构，荧荧光光几几乎乎完完全全淬淬灭灭。与与靶靶分分子子相相结结合合时时，荧荧光光基基团团和和淬淬灭灭基基团团之之间间的的距距离离增大，分子信标的荧光恢复。增大，分子信标的荧光恢复。Taqman技技术（上）及（上）及分子信分子信标技技术（下）原（下）原理示意理示意图。5.5 基因克隆（基因克隆（clone）技术）技术在在多多细细胞胞的的高高等等生生物物个个体体水水平平上上，克克隆隆表表示示由由具具有有相相同同基基因因型型的的同同一一物物种种的的两两个个或或数数个个个个体体组组成成的的群群体体。从从同同一一受受精精卵卵分分裂裂而而来来的的单单卵卵双双生生子子（monozygotic twins）便便是是属属于于同同一一克克隆。隆。在在细细胞胞水水平平上上，克克隆隆一一词词是是指指由由同同一一个个祖祖细细胞胞（progenitor cell）分分裂裂而而来来的的一一群群带带有有完完全全相同遗传物质的子细胞。相同遗传物质的子细胞。在在分分子子生生物物学学上上，人人们们把把将将外外源源DNA插插入入具具有有复复制制能能力力的的载载体体DNA中中，使使之之得得以以永永久久保保存和复制这种过程称为克隆。存和复制这种过程称为克隆。5.5.1 RACE技技术术（rapid amplification of cDNA ends）在在已已知知cDNA序序列列基基础础上上克克隆隆5或或3端端缺缺失失序序列列的的技技术术。根根据据已已知知序序列列设设计计基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物，由由该该片片段段向向外外侧侧进进行行PCR扩扩增增得得到到目目的的序序列列。用用于于扩扩增增5端端的的方方法法称称为为5RACE，用于扩增，用于扩增3端的称为端的称为3RACE。5 RACE1、在反转录酶的作用下，、在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物以基因片段内部特异性引物启始启始cDNA第一条链合成。第一条链合成。2、RNase混合物降解模板混合物降解模板mRNA，纯化第一链。，纯化第一链。3、用、用末端转移酶末端转移酶在在cDNA链链3端加入连续的端加入连续的d