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结构生物学NMR Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望X射线晶体学和NMR波谱学测定的最大结构的比较nNMR相对于晶体学的优点：nNMR使用溶液样品，因此，它不局限于那些能很好结晶的样品。nNMR可以测定不同溶液条件下的分子结构。nNMR也使得研究分子的性质相当容易，例如，研究分子的柔性、分子与其它分子的反应或相互作用、分子的动态特征等。nNMR技术的原理简述 nNMR技术依赖于一个外加磁场和某些原子核中的天然“小磁铁”之间的相互作用。n用NMR技术解析一个蛋白质的结构就象一件出色的侦探工作。n NMR使用的磁场n大多数强度范围在500mHz(11.7tesla)-800mHz(18.8tesla)之间。nNMR磁体是超导磁体nVrian公司的NMR波谱仪（见图）强度为900mHz的Vrian公司的NMR波谱仪 NMR波谱仪n连续波谱仪：60-70年代产品n结构示意图（见图）射频振荡器磁场系统探测系统记录装置n灵敏度低，已基本淘汰。n脉冲傅里叶核磁谱仪：目前流行n结构示意图3.2 NMR的基本原理n3.2.1 原子核的自旋与核磁共振n原子核的自旋量子数II与原子核的质量数和原子序数有关核自旋量子数I与质量数和原子序数的关系I=0的原子核，如12C,16O,32S等，没有自旋，不产生核磁共振现象。I0的原子核，具有自旋，可产生核磁共振现象。结构生物学中，经常研究的原子核有：1H,13C,15N,31P,它们的自旋量子数I=1/2。其中，1H核在生物分子中广泛存在，13C,15N是稀有同位素。n原子核的自旋与进动原子核都具有电荷和质量，自旋量子数I0的原子核由于能够自旋因而还具有自旋动量或角动量。旋转的电荷有磁场，有自旋的核就有与角动量有关的磁矩。在一个强大而均匀的外加磁场H0中，自旋核的磁矩将沿外磁场的方向进行取向。自旋核将产生进动。（见图）n核磁共振的产生原子核自旋轴在外加磁场H0中的取向是量子化的，每一个取向相当于一个自旋能级。H0的增加不能产生自旋能级的跃迁。在与H0相垂直的方向上再施加一个比H0弱很多的附加磁场H1（称为射频场），当H1的频率与原子核的进动频率相同时，原子核从附加磁场（射频场）吸收能量，产生自旋能级的跃迁。这就是核磁共振（见图）。n核磁共振条件的理论推导在外加静磁场H0的作用下，核自旋量子数不为零的原子核会发生能级分裂。以1H为例，其I=1/2，在静磁场H0中，它的进动可以有2I+1=2个方向，即有2个能级，分别为顺磁场和逆磁场两种取向。如图所示。b DE H0=0 a H00 能级裂分图顺磁场的1H核居较低能态，逆磁场的1H核居较高能态，二者能级差：DE=g h H0其中，g 为旋磁比，是各种核的特征常数，不同原子核的旋磁比不同。h=h/2p，h 为普朗克常数。H0为外加静磁场的强度。自旋核绕外磁场方向进动的频率为：n0=gH0/2p以上两个方程合起来得：hn0=g(h/2p)H0=DE当外加一个与静磁场H0垂直的射频电磁场 H1，使其频率满足：hn=DE=hn0时，低能态核吸收射频场能量而跃迁到高能态，于是 n=n0=gH0/2p从以上公式可以看出：发生核磁共振的条件是：照射到自旋核上的电磁波的频率（n）应等于自旋核的进动频率（n0），它不仅与核的特性（g）有关，也与外磁场的强度（H0）有关。n3.2.2 弛豫n弛豫是高能态的自旋核释放能量返回低能态的过程。通过弛豫过程可以获得稳定的核磁共振信号。n弛豫过程有两种：自旋晶格弛豫，也称纵向弛豫。以弛豫时间T1表示。自旋-自旋弛豫，也称横向弛豫。用弛豫时间T2描述。n3.2.3 吸收的测量n所有NMR波谱仪都采用测定与吸收有关的正信号。n可通过改变辐射电磁波的频率（扫频）或改变外加磁场的强度（扫场）的办法来达到共振的目的。扫频在技术上有困难。NMR谱仪都是保持射频振荡器的频率恒定，而连续改变H0的办法达到共振的目的。见图。n3.2.4 化学位移n由电子云的屏蔽作用所引起的共振时磁场强度的移动，称为化学位移。见图n化学位移与原子的核外电子云密度有关，后者又与原子核的化学环境有关。因此，可根据化学位移的大小，来考察原子核所处的化学环境，从而对化合物进行结构分析。n为了确定化学位移的大小，选一个参比核，规定其化学位移为零。对于1H谱常以四甲基硅烷（TMS）为参比。参比核的屏蔽作用很强，在最高场有一个强的尖峰，定义其化学位移为0，在其低场区（左方）的化学位移为正值。化学位移的大小用下式计算：d=(H参-H样)/H参 x 106 =(n样-n参)/n参 x 106 d的单位为ppm,即10-6，大多数质子的d 在1-12之间。n影响化学位移的三种效应：1)磁各向异性效应：苯环p电子云的影响，使处于环上方和四周的氢核的化学位移有极大的差别，见图。2）顺磁效应：顺磁离子如Mn2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+的存在对周围核的化学位移影响很大。3）化学交换：与O,N,S 等原子相连的氢原子，在溶液中常常发生质子交换。在pH值变化时，这类可交换氢的化学位移的变化非常大（见图）。氢键的形成，使这种交换变慢，化学位移向低场变化。n3.2.5 谱线强度n在常规一维谱中，谱线强度与参与共振的粒子数成正比。（见图）n3.2.6 自旋耦合与自旋裂分n自旋核的核磁矩通过成键电子影响邻近核，引起其共振谱线增多，这种现象称为自旋裂分，自旋核之间的相互作用称为自旋耦合。见图。n裂分的共振谱线的能量差，称为自旋耦合常数，以J表示。J与分子结构有关。n自旋耦合与自旋裂分可提供相互作用的核的数目、类型及相对位置等结构方面的信息。3.3 多维NMRn一维NMR谱是一个频率变量的函数：S(w)，见图n二维NMR谱是两个频率变量的函数：S(w1,w2),见图n二维NMR谱的原理n二维NMR谱中的对角线峰和交叉峰n不同类型的二维NMR波谱：二维分解谱、二维相关谱（COSY)、二维自旋回波相关谱（SECSY）、二维NOE谱（NOESY）。nNOESY谱-核欧沃豪斯效应波谱-反应的结构信息n三维NMR是三个频率变量的函数：S(w1,w2,w3),四维NMR是四个频率变量的函数：S(w1,w2,w3,w4)。见图。n多维NMR谱的特点：n多维谱可以把一维谱中的重叠峰在二维或三维方向展开，便于NMR谱的解析。n多维谱包含了比一维谱丰富得多的信息。n实验方法灵活多样，可以设计出多种实验脉冲程序，从而产生各种有用的多维NMR技术。n可以利用多维谱，间接地检测到在普通NMR谱中得不到的跃迁，如多量子跃迁。3.4 多维NMR确定蛋白质溶液三维结构的基本原理n3.4.1 蛋白质的结构信息n不同二级结构提供了具有不同结构特征的原子间距离及肽键二面角。a螺旋中，相邻两个残基的酰胺质子(1HN)在空间距离上很接近；而前一位残基的a质子（1Ha）与后一位残基的酰胺质子在空间上相距甚远；但是在b折叠中情况正相反。a螺旋肽链上的每一亚氨基与前面第四位残基的羰基形成氢键，而反平行b折叠的两条单链上相对的亚氨基与羰基之间形成氢键。b折叠的肽键二面角f远大于a螺旋中的f。n三级结构中，几个b折叠相对集中的区域会形成一个比较刚性的疏水区，而空间位置比较靠近的几个环可能成为比较柔性的活性部位。n这些具有不同结构特征的原子核间距、肽健二面角、肽链的动态特性等都是多维NMR所要提取的蛋白质的结构信息。n3.4.2 核磁共振的波谱信息直接用于测定蛋白质溶液三维结构的主要波谱参数为：n（1）化学位移：反映了空间结构及局域微环境的结构情况。n（2）J耦合常数：酰胺质子与a质子之间的耦合常数3JNa与主链的二面角f有关，a质子与b质子之间的耦合常数3Jab与侧链二面角c有关。n（3）NOE（核欧沃豪斯效应）：NOE信号强度提供了蛋白质中氢原子对之间的距离信息。n3.4.3 波谱信息与结构信息之间的对应n化学位移参数可用于判断蛋白质氨基酸序列中，a螺旋和b折叠等二级结构单元的位置。化学位移索引法（CSI）nJ耦合常数可由Karplus方程直接推算出相应的主链和侧链的二面角f和c:nNOE信号可以导出质子间距离，这是计算蛋白质溶液三维结构的最主要实验依据。3.5 蛋白质溶液三维结构的计算n由核磁共振数据计算蛋白质溶液三维结构的流程图n3.5.1 建立核磁共振波谱数据的约束文件n距离约束文件：由NOE导出的NOE距离约束 下限取1.8，上限：强NOE，2.5-2.7,中等NOE,3.0-3.5，弱NOE,5.0，很弱NOE,6.0由氢键提供的距离约束 1HN与羰基氧的距离：2.3-1.8 亚氨基15N与羰基氧的距离：3.4-2.4n二面角约束文件主链f角和侧链c角的约束n3.5.2 获得蛋白质三维结构的不同构象集合n计算NMR三维结构的软件：DGII,Xplor,DIANA等。n具体计算蛋白质三维结构时，必须要获得一个蛋白质构象的集合，包括40-50个蛋白质三维结构。n为什么要获得构象集合？n3.5.3 蛋白质NMR结构的精确性和正确性n结构的精确性：用均方根偏差（RMSD）来衡量 目前，多维NMR方法测定结构的精度可与分辨率为2-2.5的X射线晶体结构相比较。n结构的正确性：将蛋白质NMR结构与晶体结构相比较。对NMR结构进行反计算，计算可能产生的NOE交叉峰，并与NMR实验结果相对照。近年来，发展了PROCHECK软件来判断NMR结构的正确性。3.6 多维NMR方法测定蛋白质溶液三维结构的实例-胰岛素的NMR结构研究n胰岛素生化性质：n胰岛素的晶体结构：n胰岛素的NMR结构：B链羧端去七肽链羧端去七肽(B24B30)胰岛素：胰岛素：一种新晶型的结构一种新晶型的结构胰岛素胰岛素,作为治疗糖尿病的制剂，其结构和功能已被进行了广泛的研究作为治疗糖尿病的制剂，其结构和功能已被进行了广泛的研究.胰岛胰岛素存在缔合的问题素存在缔合的问题.它可以缔合成二体、四体、六体甚至六体复合物它可以缔合成二体、四体、六体甚至六体复合物.然而，然而，在生理条件下，在浓度为纳摩尔时，胰岛素将解聚成单体并发挥生理功能在生理条件下，在浓度为纳摩尔时，胰岛素将解聚成单体并发挥生理功能.因此，胰岛素六聚体解聚成单体的过程就成为人体吸收注射胰岛素的速控步因此，胰岛素六聚体解聚成单体的过程就成为人体吸收注射胰岛素的速控步.为了获得速效而保持较高活性的胰岛素制剂，人们设计了许多突变体或类似为了获得速效而保持较高活性的胰岛素制剂，人们设计了许多突变体或类似物，并对这些制剂的物理化学和生物化学特性进行了深入的研究物，并对这些制剂的物理化学和生物化学特性进行了深入的研究.3.7 蛋白质折叠的NMR研究n蛋白质折叠是很迅速的过程n研究蛋白质折叠的意义n研究蛋白质折叠的方法n肌红蛋白的折叠研究：The Sweetest Puzzle Getting a protein structure using NMR is a lot of fun,says Chele DeRider,a graduate student at the University of Wisconsin-Madison.Youre given all these pieces to a puzzle and you have to use a set of rules,common sense,and intuitive thinking to put the pieces together.And when you do,you have a protein structure.DeRider is working at UW-Madisons national NMR facility.She is refining the structure of brazzein,a small,sweet protein.Most sweet-tasting molecules are sugars,not proteins;so brazzein is quite unusual.It also has other remarkable properties that make it attractive as a sugar substitute.It is 2,000 times sweeter than table sugar with many fewer calories.And,unlike aspartame(NutraSweet?),it stays sweet even after 2 hours at nearly boiling temperatures.In addition to its potential impact in the multimillion-dollar market of sugar substitutes,brazzein may teach scientists how we perceive some substances as sweet.Researchers know which amino acids in brazzein are responsible for its taste changing a single one can either enhance or eliminate this flavor but they are still investigating how these amino acids react with tongue cells to trigger a sensation of sweetness.Getting a protein structure using NMR is a lot of fun.Getting a protein structure using NMR is a lot of fun.You start out with just dots on a page You start out with just dots on a page and you end up with a protein structure.and you end up with a protein structure.Chele DeRider Graduate Student University of Wisconsin-Madison The plum-sized berries of this African plant contains brazzein,a small,sweet protein.Photo Credit:H.M.Hadik Ming and Hellekant（1994）从西非洲热带野生植物 Pentadiplandra brazzeana Baill的果实中，分离出一种甜味蛋白质，命名为brazzein，它是由54个氨基酸残基组成的单链多肽；甜度是蔗糖的2000倍。The fruit of Pentadiplandra brazzeana Baillon contains a small,sweet-tasting protein named brazzein.The structure of brazzein in solution was determined by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy at pH 5.2 and 22 C.Caldwell,Abildgaard,et al.1998 ID:2437 The brazzein fold,which contains one alpha-helix and three strands of antiparallel beta-sheet,does not resemble that of either of the other two sweet-tasting proteins with known structures,monellin and thaumatin.Instead,the structure of brazzein resembles those of plant gamma-thionins and defensins and arthropod toxins.Sequence comparisons predict that members of a newly-identified family of serine proteinase inhibitors share the brazzein fold.Ribbon diagram of the NMR structure of brazzein.The beta-strands are labeled,and all four disulfide bridges are shown.Solution Structure of the Thermostable Sweet-Tasting Protein Brazzein思考题n1.比较NMR与X射线晶体学在测定生物大分子结构上的优点和缺点。n2.在结构生物学中，用于获取NMR信号的原子核有哪些？n3.用于确定蛋白质分子结构的NMR波谱参数有哪些？它们包含了什么结构信息？n4.NOESY谱提供了什么结构信息？n5.研究蛋白质折叠有什么意义？