实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法.docx

试验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培育的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞 在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必需使其坚固贴附于载玻片上。在载玻 片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是常常采纳的方法之一。能促进细胞黏附 的物质主要有多聚赖氨酸、铭矶明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min,间或振荡。2、用自来水冲洗5min。3、以1%盐酸一70%乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱干燥（至此即可用于一般染色）。5、多聚L-赖氨酸（1:10溶于去离子水）浸泡5min,振荡。6、入60c烤箱lh,或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原位 杂交细胞化学）。二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避开 组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性, 防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能精确 定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生转变和破坏。同时，固定还可使细 胞的各局部易于着色，适于观看、长期保存和分析。1 .固定组织、细胞的基本原那么：尽可能选用新奇培育物；依据检测工具、对 象、目的和要求选择固定剂和固定方法。2 .培育物的预备和固定前处理：各种细胞培育物，如双盖片悬滴培育物、悬 液培育物、单层培育物和盖片单层培育物都可作固定材料。对双盖片悬滴培育物 和悬液培育物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗23次后，备固定制片； 对盖片单层培育物来说，将盖片从培育器皿中取出后，PBS液漂洗23次，以 洗去血清和附着于细胞外表的残渣，备固定用。3 .常用固定液:常用的固定液分两类,一类是以单一化学物质配成的固定液, 称简洁固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铭酸、 重倍酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锹（饿酸）。另一类是用两种或两种以上化学 物质协作成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA 固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合 适的固定液是到达固定目的的基础。(1)4%甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40%甲醛。在 许多状况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4%甲醛-PBS使组织变硬速度 比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料 可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定匀称，能增加 组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体 的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40%甲醛水溶 液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮为无色易挥发液体,用纯冷丙酮(4C)固定细胞内酶效果较佳。(3)乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细 胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固 定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的相宜 浓度为70%100%。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。(4)醋酸：常用0.3%5%浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇 溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨胀 作用显著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合，所以，常用醋酸来削减其 他固定剂引起的细胞收缩。细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好地 保存染色体，还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。(5)苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯， 在水中的溶解度可因水温变化而变化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、 组蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，单独使用时，造成组织严峻收缩。它和其 他药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避开组织收缩、硬化，而 且易于染色。所以在许多混合固定液中被广泛采纳。作固定用的最适浓度为1%。(6)锹酸(四氧化钺)：锹酸是一种强氧化剂，不能同乙醇和甲醛混合使用。 它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特 殊留意。四氧化饿是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中 盛入50100ml 0.101014磷酸缓冲液8117.07.4),再将装有1g锹酸的安培瓶 放人PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使饿酸溶解，备用。常用的固定液浓度为 1% 2%。(7)戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反响快，能较好地保存蛋 白质，对微管和膜性结构保存亦比拟好，并能较好地保存糖原。常用的戊二醛固 定液配制方法列于表12-1 o表12-1常用的戊二醛固定液配制方法Ph7.2的0.Imol/L磷酸缓冲液(ml) 969692908825%戊二醛水溶液(ml) 4681012戊二醛的终浓度1%1. 5%2%2. 5%3%(8)甲醇/醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培育 细胞固定剂。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形 态不变。不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于Giemsa染色(留意： 此固定液宜现用现配)。(9)FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培育的细胞，固定效果好。 配制方法：90ml 80%酒精中加5ml冰乙酸和5ml40%甲醛。(lO)Camoy固定液：Camoy固定液是较好的非水溶性固定液，是显示细胞 化学成分(如粘多糖等)时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，适于 固定培育的单层细胞。配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。(H)Bouin固定液：用于固定双盖片法培育的标本，固定30分钟后，用70% 酒精褪去苦味酸黄色，如不马上染色，可将标本保存在70%酒精中。本试剂适 于固定组织细胞的糖原。配制方法：先将75nli饱和苦味酸(100ml水中加L 2 1.4g)过滤，加入251nl福尔马林(40%甲醛，有沉淀时禁用)，最终加入5ml冰醋 酸，混和后存于4c冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。该固定液对组织细 胞穿透力较强，固定效果较好，保存的细胞结构完好。但因偏酸(pH为33. 5), 对抗原有肯定损害。(12)4%多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，在50nli蒸t留水中加 入4g多聚甲醛，加热至6070时-，边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH,至液体清 楚透亮。用Imol/LHCl调整pH 至7. 4,冷却后加入 0. Olmol/LPBS液至100ml, 4c保存。本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白。 三、常见的细胞染色方法 1一般染色观看苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和Giemsa染色是观看培育细胞 一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培育 的细胞，以生长于盖玻片和塑料培育瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、 BSS或生理盐水清洗培育物2次，去除阻碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树 胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培育细胞，须先经离心沉淀(1000r/min, 10min),弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风 吹干。1. 1HE染色法1. 1. 1染液配制苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5. 0g 钱矶或钾矶，0.1g碘酸钠加温溶于70ml蒸储水。再加入30ml甘油，2nli冰 醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长期保存。用蒸储水以1:20稀释即成工作液, 可用很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100ml70%乙醇或 蒸储水即成工作液。1. 1. 2染色程序(1)用10%甲醛(福尔马林)固定培育物30min,或以丙酮固定15min。(2)蒸储水洗1次后，入苏木精染液5lOmin染细胞核。(3)入0.5%盐酸-70%乙醇溶液30Imin,脱去胞质的着色。此时核呈紫 红色。(4)入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。假如时间允许，最好用自来水(呈弱 碱性)长时间浸泡。也可入l%NaHC03溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌 握碱化时间。(5)蒸储水洗1 min,去除残留的碱性溶液，否那么影响伊红着色。(6)入伊红染液30s1 mino(7)用梯度乙醇溶液脱水：70%、90%、95%乙醇各30s1 min； 100% (2次) 各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70%乙醇。(8)用二甲苯透亮2次，各5min。(9)树胶封固。1. 1.3染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大局部细胞的胞质呈粉红色。假如胞质内含较多核糖 体(例如淋巴细胞)那么亦呈蓝色。1.2吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易精确 把握，效果常不如HE染色稳定。1. 2. 1吉姆萨(Giemsa)染液的配制(1)取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60温箱，约3h后溶解。(2)取出后倒入50nli中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长期保存。需要留意的 是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。(3)将母液与0.1 mol/LPBS(Ph6.97. 2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染 液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时那么过蓝。所以，工作液宜现用现配， 保存时间不超过48h以免被CO2酸化。染色程序(1)将标本用甲醇固定5lOmin。(2)入吉姆萨液染色1015min。可用染色缸；或将染液滴覆于标本。(3)蒸储水清洗，空气干燥，二甲苯透亮，树胶封固。1.2. 3染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。(三)瑞氏-吉姆萨染色法 瑞氏染液的配制：称取1啤瑞氏色素放入研钵中，研磨成粉状，加少量廿油，继续研磨呈一 面镜状，加稍多甲醇研磨，配制成600ml染液，转入棕色广口瓶中保存。(封存两个月以上 使用，时间越长效果越好)染色方法：细胞悬液涂于玻片上，晾干用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖稍等片刻再加吉姆萨染液2-3滴加减(根旅片上细胞多少酌情而定)稍等l-2min后，再加PBS,加时缓慢地一滴一滴加在涂片膜上，直至膜面上染色液形成 外表张力而终止染色液加入，染色30min左右。用超纯水缓慢冲洗至少3分钟以上，待干。