低温低功率等离子体处理对复合蛋白基薄膜结构性能的影响.docx

低温低功率等离子体处理对复合蛋白基薄膜结构性能的影响蛋白质基薄膜被认为是食品包装开发中最有潜力的生物可 降解聚合物，因为蛋白质紧密的空间构象使得其具有高于普 通塑料膜的阻隔性能，能够很好地保护食品不受外界气体和 水分渗入的影响而发生氧化和腐败，从而延长食品的保质期lo本文大量的前期研究工作发现乳清别离蛋白-酪蛋白酸钠复合蛋白膜是一类具有高强度、高阻隔性的相对较为疏水 的可食性薄膜2。为了强化其结构稳定性、改善薄膜拉伸 性能和对水分的敏感性，前期采用了不同方式对复合蛋白膜 进行改性，如在成膜溶液中加入多糖的方式，构建蛋白质- 多糖美拉德反响体系，显著提高了薄膜疏水性和阻隔性能, 并使薄膜具备了一定的抗氧化特性此外，通过使用静态超高 压、等离子体处理成膜溶液所制备而得的复合蛋白膜也呈现 出更加优良的成膜特性3-5。等离子体可分为高温等离子体和低温等离子体。处于核聚变 状态的物质、电弧、闪电、极光等都是高温等离子体，高温 等离子体在切割、冶炼、焊接等领域都有广泛的应用。低温 等离子体技术是一种能够对敏感材料进行灭菌和改性的新 兴非热技术，能够利用放电产生的自由基、电子、正负离子、 原子和分子的激发态或基态以及紫外线光子等物质，通过刻 蚀、交联和氧化反响来温和地修饰蛋白质的结构6。因此， 的趋势。因此判断较低能率等离子体处理能够增加折叠 和a-螺旋的含量，进而提高薄膜的热稳定性。2. 4机械性能的变化等离子体处理时间对复合蛋白膜机械性能的影响如表3所示。 图3不同时长等离子体处理的薄膜DSC热分析图Fig. 3DSCthermogramoffilmstreatedwithplasmafordiffer entdurations表2不同时长等离子体处理的薄膜样品的热力学参数Table2Thermodynamicparametersoffilmstreatedwithplas mafordifferentdurations由表3可知，随着等离子体处理时间的延长，抗拉强度呈先 上升后下降的趋势，在处理lOmin时抗拉强度显著增大至 12. 46MPa(P0. 05),而后逐渐降低至7. 72MPa,而薄膜的断裂 伸长率与抗拉强度的变化那么与之呈相反的趋势。在等离子体 处理过程中，基于材料外表吸收的能量和等离子体产生的反 应物质，聚合物结构中会发生降解，官能化，刻蚀和交联等 反响23。其中，抗拉强度的增加与断裂伸长率的减小可能 是由于等离子体在轰击蛋白薄膜时，产生的自由基与薄膜表 面自由基发生链反响，清除了大量低分子质量碎片，使得薄 膜的抗拉强度有显著提升23。而处理1520min时，薄膜 抗拉强度降低，断裂伸长率升高，这是由于长时间、较高能 率离子体处理过程中，通过官能化反响将含有氧或氮自由基 的官能团引入聚合物外表，导致聚合物网络中自由体积的增 加，形成了许多松散的低分子质量有机分子8。除此之外， 等离子体可能导致了过氧化物、羟基和竣酸的形成，它们对 薄膜柔韧性起到一定的影响作用，这也解释了抗拉强度和断 裂伸长率变化的原因24。2.5 阻隔性能的变化表3中水蒸气透过系数和氧气透过率数值显示，与未经等离 子体处理的薄膜相比，等离子体处理5lOmin可显著降低 水蒸气透过率和氧气透过系数(PO. 05),即，阻隔性显著提 高，水蒸气渗透系数由未处理的 6. 51X 10-12g cm/ (cm2 s Pa)降低至 lOmin 后 的 5. 555X10-12g cm/ (cm2 s Pa),降低了 14. 67%,氧气透 过率由 2. 065cm3/ (m2 d)降低至 1. 20cm3/(m2 d),降低 了 41. 80%o而处理1520min后，相较于未处理的薄膜，薄膜 水蒸气透过系数和氧气透过率分别升高了 8. 90%和160. 05%o 表3等离子体处理的薄膜机械性能、氧气透过率和水蒸气渗 透系数数据Table3Datasofmechanicalproperties,oxygenpermeab i1i t yandwatervaporpermeabilityoffilmstreatedwithplasmaf ordifferentdurations水蒸气和氧气的渗透性是选择任何食品包装材料的关键参 数。水蒸气的渗透取决于聚合物2个外表上的蒸气压和浓度 梯度，这取决于扩散和溶解机理。气体渗透率也是扩散和溶 解度的综合作用，其中渗透物通过聚合物链各段之间存在的 间隙的空隙进行传输25。等离子体处理后交联的产生是改 善薄膜的阻隔性能的一个原因，聚合物链之间的交联量的增 加导致聚合物链之间的自由体积减小，因此减少了水和氧分 子的扩散，同时，在等离子体处理后，由于等离子体中高度 激发的离子，电子和分子而形成的分子间和链间键也导致可 生物降解膜对阻隔性能提高26。此外，等离子体处理后随 着聚合物极性的增加，内聚能密度增加，使渗透物质更难打 开聚合物链并渗透，使得薄膜阻隔性能提升27。在更长的 等离子处理时间(1520min)下，等离子体释放的更高能量 使得刻蚀反响剧烈，水蒸气和氧气分子的渗透变得容易，从 而导致较差的阻隔性能。2.6 接触角的变化图4显示了不同时长等离子体处理对复合蛋白膜的水、油润 湿性的影响。等离子体处理lOmin后，复合蛋白膜的水接触 角(watercontactangle, WCA)显著降低 了 9. 18%,从 68. 99° 降至62. 654° (P0. 05) o延长等离子体处理时间，其WCA值 进一步降低至 54. 91° ,油接触角(oilcontactangle, OCA) 也显著降低至39. 41° (P0. 05) o这说明等离子体显著增强了 复合蛋白基膜的外表亲水性和亲油性(P0. 05),造成这种现 象可能的原因如下：一方面等离子体的刻蚀反响导致了薄膜 粗糙的外表微观结构（如SEM显微照片所示）9。此外，除 了刻蚀，通过低能率等离子体处理形成的活性极性基团也有 助于提高外表张力和外表自由能（特别是极性组分）。本实验 以空气为反响介质，以氧气为主要活性气体，因此，诸如羟 自由基和原子氧等的活性氧可能与薄膜外表蛋白分子中氢 化合物反响，从而使得外表亲水性和亲油性增加21,28 o 如图4所示，当等离子体处理时间延长至20nlin时，复合蛋 白膜的WCA和0CA分别降低了 20. 40%和33. 54%,这可能是 由于高能率等离子体强烈的刻蚀作用导致其极性基团暴露 于外表，进而提高了薄膜的亲水性和亲油性29。图4不同时长等离子体处理薄膜的水和油接触角Fig. 4WaterandoiIcontactangleoff i1mstreatedbyplasmaf ordifferentdurations2. 7光学性能的变化图5是不同时长等离子体处理薄膜的透光率和雾度变化图, 由图5可以看出，5lOmin等离子体处理显著影响了薄膜的 光学性能（P0.05）,薄膜透光率降低了约20%,雾度提高了 28%,持续延长等离子体处理时间，薄膜的透光率又有了轻 微上升。该结果的产生可能是由于低能率的等离子体处理过 程中，蛋白质大分子的聚集影响了光的通过，并且薄膜粗糙 的外表阻碍了光的垂直透射。而高能率等离子体使得薄膜结 构破坏产生微孔，又增强了薄膜的透光性30。图5不同时长等离子体处理薄膜的透光率和雾度Fig. 5Lighttransmittanceandhazeoffi1mstreatedbyplasm afordifferentdurations2. 8水溶性的变化如图6所示，等离子体处理5lOmin后，复合蛋白膜的水 溶性有轻微下降，薄膜处理lOmin后水溶性降低了 10%,而 更长时间的处理使得其水溶性又有所上升。这是由于短时间 低能率的等离子体处理使得内聚能密度增大，蛋白质分子间 聚合度增加，水分子更难浸入，而薄膜外表粗糙度的增加又 使得薄膜外表更加亲水，因此在低能率等离子体处理条件下, 薄膜的水溶性没有大幅变化，而高能率等离子体破坏了蛋白 质结构使得其极性基团暴露，增加了蛋白基薄膜对水分的敏 感性29。图6不同时长等离子体处理薄膜的水溶性Fig. 6Watersolubi1ityoffilmstreatedbyplasmafordiffer entdurations2. 9薄膜菌落总数变化表4的结果显示，等离子体处理能够有效杀灭薄膜外表的菌 落：5min处理后，薄膜外表菌落明显减少了 85%, lOmin后 进一步降低至20CFU/g,继续延长等离子体处理时间菌落总 数都低于10CFU/go等离子体中反响性物质包括单线态氧、 羟自由基和超氧阴离子以及过氧化氢、臭氧、亚硝酸根离子 和硝酸根离子等，其中单线态氧累积产生氧化反响的同时羟 自由基也能够作为最强氧化剂，破坏细菌细胞膜从而杀灭细 菌。超氧阴离子可以在等离子体创造的酸性环境中转化为过 氧自由基，更容易渗透到细胞壁并诱导细胞死亡31。3结论等离子体处理时间及能率对复合蛋白膜的各项性能均存在 显著影响（P0.05）。经过短时间（5lOmin）、较低能率等离 子体处理，蛋白质中a-螺旋、B-折叠的百分比上升，复合 蛋白薄膜外表粗糙度上升，蛋白质结构更加有序稳定，热稳 定性也明显提升，薄膜的疏水性下降，机械性能、阻隔性能 都呈现上升趋势；而长时间（1520min）、高能率等离子体 处理薄膜，等离子体过度剧烈的刻蚀反响导致薄膜出现孔洞, 破坏了薄膜致密的结构，热稳定性下降，同时降低了其机械 性能和阻隔性能。除此之外，等离子体处理也能够有效杀灭 薄膜外表微生物。表4不同时长等离子体处理的薄膜菌落总数Table4Totalviablecountsoff11mstreatedwithplasmaford ifferentdurations综上所述，对复合蛋白膜进行lOmin左右、低能率的等离子 体处理，能够改变薄膜外表结构，提升热稳定性、机械性能、 阻隔性能，降低薄膜透光性和水溶性，同时具有优良的薄膜 外表的灭菌功能，满足了食品包装在食品工业中应用的加工 性及平安卫生性要求，进一步拓展了绿色包装材料的研发空 间，也为低温等离子体技术的多功能应用提供了可能。低温等离子体技术被视为物理、化学和光化学修饰技术的组 合体7。低温等离子体技术作为一种材料外表处理技术， 在不损伤材料本身性能的情况下能够有效提高聚合物的黏 合性和功能性，如，低温等离子体在放电过程中轰击薄膜表 面，会导致其形态在微米到纳米范围内发生巨大变化，同时 会使晶体含量和位置改变，薄膜结构中的活性基团异变，最 终对薄膜外表粗糙度、油墨附着力、机械性能、阻隔性能、 接触角和生物降解性产生一定程度的影响作用1,8-9 o PANKAJ等10研究结果显示，低温等离子体处理明胶薄膜后 增加了薄膜外表粗糙度，并且粗糙度取决于等离子体的处理 时间。输入的功率对等离子体处理的效率有很大影响，较低 功率的等离子体处理可以减小实验过程中形成的臭氧以及 氮氧化合物对聚合物产生的过度氧化n。除此之外，等离 子体处理过程中，由于活性氧的累积而产生氧化反响，使得 细菌细胞膜破裂死亡，这也赋予了等离子体技术在一定条件 下具有高于一般灭菌技术效率的能力12-13。为此，为了深入探究低温低功率等离子体处理技术在蛋白基 薄膜成膜工艺中的应用，开发其潜在的功能特性，本文拟在 前期对复合蛋白基成膜溶液等离子处理的研究基础上3, 进一步对成型薄膜进行不同程度的低温等离子体处理，通过 分析薄膜蛋白质二级结构变化、微观形态、热稳定性、外表 亲水性和亲油性、机械性能、阻隔性能以及灭菌能力的变化,进一步提升复合蛋白基薄膜性能的改良空间，以力图使其适 应于现代食品包装的产业化生产及应用，同时，也为低温等 离子体技术在食品工业中的应用潜力提供理论依据。1材料与方法实验材料乳清别离蛋白粉（蛋白质98%）,美国ISOPURE公司；酪蛋白 酸钠（蛋白99.21%）,上海麦克林生化科技；丙三醇 （甘油，分析纯），上海麦克林生化科技；去离子水， 自制。1.1 实验仪器PiezobrushPZ2等离子处理仪，德国RPplasma公司；T25数显型高速分散机，德国艾卡公司；PERMATRAN-WMode 11 /50G水蒸气透过率测试仪、0X-TRAN2/21氧气透过率测试仪，美 国MEC0N；XLW（EC）型智能电子拉力试验机，济南 蓝光机电技术；JC2000C接触角测量仪，上海中晨 数字技术设备；SU5000热场发射扫描电镜，日本日 立高新技术公司；Q2000差示扫描量热仪，美国TA仪器公司;NicoletiSlO傅立叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技；WGT/S透光率/雾度测定仪，上海精科仪器。1.2 实验方法1. 3.1薄膜制备及等离子体处理方法称量24g乳清别离蛋白粉、16g酪蛋白酸钠粉末分别溶解于400mL去离子水中。溶液于室温下搅拌60min混合均匀后升 温至85C同时连续搅拌30min以使蛋白变性。溶液冷却至室 温后加入14g甘油，室温下搅拌均匀，真空脱气后，将溶液 等量倒入制膜容器中，置于65(鼓风干燥箱中干燥5h,薄 膜成型后揭下。使用等离子体处理仪对在距离薄膜1.5cm处 对大小为5cmX5cm薄膜外表进行5、10、15、20min的处理。 最后,薄膜置于23、50%相对湿度(relativehumidity, RH) 的恒温恒湿箱中放置待测3。1. 3. 2傅立叶红外光谱扫描利用傅立叶红外光谱研究蛋白质的结构和分子间的相互作 用。在4cm-1的分辨率下，从4000到500cm-l扫描所有薄 膜16次，并通过0mnic8. 0软件分析光谱14。1. 3. 3 电镜扫描(scanningelectronmicroscope, SEM)通过SEM拍摄等离子体处理后薄膜的外表微观形态。通过将 样品胶粘到样品台上，喷金以提高图像分辨率和比照度，在 6kV的加速电压分析薄膜外表微观形态15。1. 3. 4 差示扫描量热(differentialscanningcalorimetry, DSC)称量薄膜样品(约5mg),在氮气保护下(吹扫气流为20mL/min),以10/min的加热速率从0到225C进行分析，使用Universalanalysis2000软件对图形和数据进行处 理14。1. 3. 5外表接触角测量室温下，裁剪3cmX3cm薄膜置于悬滴液下0. 5cm处，向薄 膜外表滴约311nl的液体，并用相机记录图像，用ImageJ软 件对获取的图像进行分析16。1.3. 6机械性能测定裁剪1.5cm宽和5cm长的薄膜样品固定于智能电子拉力机夹 具之间。初始夹距为501nm,拉伸速度设置为300mm/min,持 续施加拉力直到薄膜断裂。记录样品拉伸强度和断裂伸长率 16 o1.4. 7阻隔性能测定利用红外法测量样品的水蒸气透过率，设置水蒸气透过率测 量仪参数：样品两侧湿度差为90%,测试温度为25七。测量 结束记录样品水蒸气透过率并计算水蒸气透过系数2。氧气透过率测试是根据PANKAJ等16实验仪器参数进行修 改，用样品切割工具对样品进行剪裁成50cm2的样品待用， 在环境温度为23七下进行测试。1.5. 8光学性能测定裁剪样品膜4cmX4cin,置于透光测试仪的夹具上，使仪器发 射出的光束垂直透过样品膜，记录薄膜透光率和雾度值3。1. 3. 9水溶性测定裁剪样品膜3clliX3cm, 105七烘干24h,记录初始质量ml。在室温下，将薄膜浸入放有501nL蒸镭水的烧杯中，静置Id。取出未溶解的薄膜样品，并于105C烘箱中干燥，称量直至 恒重(0. 0002g),最终质量记为川2 (g)。薄膜水溶性 (watersolubility, WS)根据公式(1)计算而得3： (1) 1. 3. 10等离子体处理薄膜菌落总数测定根据GB4789. 22022117分别对处理时间为0、5、10、15、20min薄膜菌落总数测定。1. 3. 11统计分析采用Origin2022b进行作图分析，使用SPSS20. 0软件对数据进行统计处理，概率值的P0. 05被认为是显著的，利用Omnic软件(0MNIC8. 0)和Peakfitv4. 12分析样品的光谱图。2结果与分析1 薄膜的傅里叶变换红外光谱 (Fouriertransforminfraredspectroscopy, FTIR)分析采用FTIR表征等离子体处理薄膜前后的蛋白质二级结构变 化，如图1所示。结果显示，不同等离子体处理的蛋白薄膜 样品均呈现出相似的红外光谱，说明在等离子体放电过程中, 官能团在不同的处理时间及强度条件下，能够基本维持稳定。 由于位于16001700cm-1的酰胺I带(C0拉伸振动)是蛋白 质构架中最突出和最敏感的振动带，并且与蛋白质二级结构 有关，因此,对酰胺I带进行分峰拟合计算二级结构百分比， 通过傅里叶自去卷积、高斯二阶拟合和计算(表1),其中，Q-螺旋在 1650-1660cm-1 处，8-折叠在 1610 1640cmT 处，转角在16601700cm-1处，无规那么卷曲在1640 1650cm-l 处18。图1不同时长等离子体处理的薄膜FTIR光谱Fig.IFTIRspectraoffi1mstreatedwithplasmafordifferen tdurations由表1可知，等离子体处理会对薄膜蛋白质二级结构含量产 生波动性影响，当等离子体处理lOmin后，a-螺旋的百分 比从16. 47%逐渐升至19. 12%,提高了 16.10%,而折叠 的百分比由未处理的37. 70%升高至43. 04%,提高了 14. 16%, 随着处理时间延长至20min, a -螺旋百分比减少至17. 04%, 降低了 10.87%, 折叠的百分比减少至41.97%,降低了 2. 4%。可以看出，Q-螺旋百分比的变化速率要高于B-折叠 百分比的变化速率，并且两者都在短时间较低能率等离子体 处理过程中百分比变化幅度更大。此外，数据显示在等离子 体处理过程中，转角和无规那么卷曲所占百分比都呈现出 下降趋势。上述变化显示出，复合蛋白基薄膜的有序结构被等离子体放 电处理所改变，这归因于等离子体放电过程中产生的活性氧 和活性氮的作用，对氢键产生影响，导致每个结构发生少量 变化19。由于a-螺旋比例的提高可能会在蛋白质结构中 引入二硫键，因此蛋白膜结构更加稳定，同时，B-折叠程 度的增加也稳定了蛋白质结构，说明了较低能率等离子体处 理可以提高蛋白膜的稳定性20。D0NG等6也发现了相似 的变化。表1不同时长等离子体处理的薄膜蛋白质二级结构百分比组 分变化TablelPercentageofthesecondarystructureoffi1mstreat edwithplasmafordifferentdurations2. 2外表微观结构变化如图2所示，未经等离子体处理的蛋白膜外表光滑，有轻微 的空洞，在处理5min后空洞逐渐消失，开始出现细微的突 起，这可能是由于蛋白质聚合导致的；当lOmin等离子体轰 击薄膜后，薄膜吸收能量使得外表孔洞完全消失，粗糙度增 加，颗粒感更加明显。根据PANKAJ等21的报道，物理刻 蚀（物理除去低分子碎片）和化学刻蚀（键的断裂，断链，化 学降解）是造成刻蚀发生的主要原因。由于等离子体处理产 生刻蚀效果，导致薄膜外表更为粗糙；而经过1520min等 离子体处理后，薄膜出现了较大、较多的孔洞，且随着处理 时间的延长，孔洞变多，该现象的发生与高能率等离子体处 理过程中过于剧烈的刻蚀反响有关，这与PANKAJ等10研 究有相似之处。a-放大7000倍电镜图；b-放大1000倍电镜图图2不同时长等离子体处理的薄膜外表电镜图Fig. 2SEMimagesofsurfacesoffilmstreatedwithplasmafor differentdurations 2. 3热性能分析薄膜的热流密度与温度之间的变化关系如图3所示，不同时 长等离子体处理后的复合蛋白膜的玻璃态转变温度(Tg)、热 分解温度(Td)和焰变值(AH)如表2所示。从DSC热分析图 和表2中数据可以看出，等离子体处理经过5和lOmin后,Tg分别由145. 56升至148. 07和150. 60。但是，随着 等离子处理时间延长至20min, Tg又降低至143.84,这显 示可能存在某种结构退化。这一观察结果与FTIR结果一致： 处理5和lOmin样品中较高的a -螺旋和折叠结构说明 蛋白质形成了更规那么有序的结构，结晶度提高，因而蛋白质 链的移动受到限制使得Tg升高。然而，当等离子处理时间 延长到20min,等离子体放出能量进一步升高，继而会引发 化学刻蚀和蛋白质链断裂，从而导致自由体积的增加并降低 玻璃态转变温度10。由图3和表2可知，对照未进行等离子体处理薄膜的Td约 为183.7HC,处理了 lOmin的复合蛋白膜Td提升了约73%,而在延长等离子体处理时间时，薄膜Td下降至191. 35 (20min),这可能与等离子释放出的不同能量使得 蛋白质聚集程度变化有关。与此同时，还观察到处理时间延 长会降低分解峰的强度及其焰值，MIAO等22观察到了相同