中药制剂分析第五章、中药制剂中各类化学成分的分析.ppt

第五章、中药制剂中各类化第五章、中药制剂中各类化学成分的分析学成分的分析 内蒙古医学院药物分析教研室内蒙古医学院药物分析教研室第一节第一节 生物碱类成分分析生物碱类成分分析一、概述一、概述 生生物物碱碱是是生生物物界界除除生生物物体体必必须须合合成成的的含含氮氮化化合合物物之之外外的的所所有有含含氮氮的的有有机机化化合合物物，因因其其结结构构中中氮氮原原子子上上的的未未共共用用电电子子对对而而大大多呈碱性多呈碱性。小檗碱小檗碱(berberine)苦参碱苦参碱(matrine)N延胡索乙素延胡索乙素(corydalis)l二、结构特性和理化性质二、结构特性和理化性质l（一）结构特性（一）结构特性u大多含有大多含有C，H，N，O组成组成u结构复杂，结构类型较多结构复杂，结构类型较多u氮原子有多种形式氮原子有多种形式u有羧基有羧基,酚羟基等酸性官能团及酯键取代酚羟基等酸性官能团及酯键取代l(二二)理化性质理化性质l 1.物理性质物理性质u多为结晶型固体，少数为液体多为结晶型固体，少数为液体u一一般般生生物物碱碱为为白白色色或或无无色色，但但结结构构中中具具有有较较长长共共轭轭体体系系，并并有有助助色色团团的的可可显显不不同颜色同颜色u旋旋光光性性与与胜胜利利活活性性相相关关，左左旋旋体体比比右右旋旋体生理活性强体生理活性强生物生物碱的碱的酸性酸性水溶水溶液或液或稀醇稀醇溶液溶液硅钨酸硅钨酸磷钨酸磷钨酸磷钼酸磷钼酸(BH+)4Si(W3O10)4(淡黄色或灰白色淡黄色或灰白色)3BHPO412WO32H2O（白色至褐色）（白色至褐色）3BH3PO412MoO32H2O （白白色色至至黄黄褐褐色色,加加氨氨水水转变为兰色）转变为兰色）3.沉淀反应沉淀反应l4.呈色反应呈色反应l5.碱性碱性l 生生物物碱碱碱碱性性强强弱弱是是中中药药制制剂剂分分析析时时供供试试品品溶溶液液制制备备、某某些些分分析析方方法法建建立立及及条条件件选选择的依据。择的依据。+酸性染料酸性染料有色配合物有色配合物一定一定pHpH值值l三、定性鉴别三、定性鉴别l（一）一般理化鉴别（一）一般理化鉴别l 沉淀反应是生物碱最常用的鉴别方法。沉淀反应是生物碱最常用的鉴别方法。l 有有些些成成分分也也可可与与试试剂剂生生成成沉沉淀淀而而造造成成假假阳性结果。阳性结果。(二二)色谱鉴别色谱鉴别 1 1薄层色谱法薄层色谱法 溶剂提取溶剂提取浓缩浓缩净化净化层析层析生物碱显色剂生物碱显色剂颜色反应或荧光颜色反应或荧光供试品供试品生物碱生物碱点样点样+如如用用硅硅胶胶为为吸吸附附剂剂时时,一一般般应应用用碱碱性性系系统统展展开开剂剂较较多多,或或使使生生物物碱碱的的薄薄层层分分离离在在碱碱性性环环境下进行。境下进行。注意注意l2 2纸色谱法纸色谱法 l 多为薄层色谱所代替，多为薄层色谱所代替，l 利利用用多多缓缓冲冲纸纸色色谱谱来来快快速速鉴鉴别别乌乌头头中中双双酯酯类类生生物物碱碱和和醇醇胺胺类类生生物物碱碱有有其其独独到到之之处。处。l3 3高效液相色谱法高效液相色谱法 l 在在恒恒定定的的高高效效液液相相色色谱谱条条件件下下，各各种种生生物物碱碱都都具具有有一一定定的的保保留留时时间间，可可作作为为定定性性鉴鉴别别的的参参数数。一一般般要要求求取取得得两两个个色色谱谱系系统统的的保保留留时时间间，或或应应用用二二级级管管阵阵列列检检测测器器作出鉴定作出鉴定四、含量测定四、含量测定 (一一)总生物碱含量测定总生物碱含量测定 1.1.化学分析法化学分析法 包括重量分析和容量分析包括重量分析和容量分析 主要使用酸碱滴定法主要使用酸碱滴定法l 酸碱滴定法：酸碱滴定法：la.a.游游离离生生物物碱碱不不溶溶于于水水，可可先先将将生生物物碱碱溶溶于过量标准酸溶液中于过量标准酸溶液中,再用标准碱溶液回滴再用标准碱溶液回滴lb.b.生生物物碱碱盐盐在在水水或或乙乙醇醇介介质质中中，用用强强酸酸溶溶液液滴滴定定。一一般般使使其其溶溶于于9090乙乙醇醇溶溶液液中中，可用标准酸乙醇液滴定，用酚酞作指示剂。可用标准酸乙醇液滴定，用酚酞作指示剂。l重量分析法：重量分析法：l（1 1）将将生生物物碱碱从从中中药药制制剂剂中中提提取取，用用适适宜的方法使其生成沉淀，干燥后直接称重宜的方法使其生成沉淀，干燥后直接称重l 优点优点:l 计计算算简简便便，不不用用换换算算因因数数，不不必必考考虑虑生物碱的分子量。生物碱的分子量。缺点缺点 挥挥发发性性生生物物碱碱，蒸蒸发发提提取取溶溶剂剂或或加加热热、干干燥燥时时能能分分解解破破坏坏以以及及加加碱碱使使生生物物碱碱游游离离时可发生水解的生物碱不可用此法。时可发生水解的生物碱不可用此法。取样量大，操作时易乳化，费时。取样量大，操作时易乳化，费时。l（2）加加入入某某些些试试剂剂，使使生生物物碱碱生生成成不不溶溶性性沉淀，称量沉淀沉淀，称量沉淀,计算生物碱的含量。计算生物碱的含量。l优点：优点：l 取样量少，灵敏度高。取样量少，灵敏度高。l缺点缺点l 繁琐，影响因素多，干扰多。繁琐，影响因素多，干扰多。l2.分光光度法：分光光度法：l（1）直接测定法）直接测定法l 利利用用生生物物碱碱自自身身的的光光吸吸收收直直接接进进行行比比色色测定的方法。测定的方法。l 一一般般用用于于药药味味较较少少，干干扰扰不不大大的的中中药药制制剂中生物碱的含量测定。剂中生物碱的含量测定。l（2）离子对萃取比色法）离子对萃取比色法l原理：原理：l 在在一一定定的的pH介介质质中中，有有机机碱碱与与一一些些酸酸性性染染料料或或磺磺酸酸类类、酸酸类类的的阴阴离离子子，定定量量的的结结合合为为有有色色离离子子对对，此此离离子子对对可可定定量量的的溶溶于于某某些些有有机机溶溶剂剂，然然后后在在一一定定的的波波长长下下测测定定有有机机溶溶剂剂或或经经碱碱化化后后释释放放的的染染料料的的吸吸收收度。度。1.1.酸性染料比色法：酸性染料比色法：l本法测定的关键在于本法测定的关键在于l介质的介质的pHpH值，值，l酸性染料的性质，酸性染料的性质，l有机溶剂的性质有机溶剂的性质。2.2.苦味酸盐法：苦味酸盐法：凡凡是是在在弱弱酸酸或或中中性性溶溶液液中中能能与与苦苦味味酸酸定定量发生沉淀的生物碱量发生沉淀的生物碱,都可按本方法测定含量。都可按本方法测定含量。a.a.是是滤滤取取生生物物碱碱-苦苦味味酸酸盐盐沉沉淀淀，加加碱碱使使生生物物碱碱-苦苦味味酸酸盐盐解解离离，然然后后以以有有机机溶溶剂剂提提出出生生物物碱碱，将将苦苦味味酸酸的的碱碱性性水水溶溶液液进进行行比比色色，再换成生物碱的含量。再换成生物碱的含量。l b.在在pH为为7的的缓缓冲冲液液中中，使使生生物物碱碱与与苦苦味味酸酸结结合合成成盐盐，用用氯氯仿仿提提取取此此盐盐，然然后后再再以以pH为为11的的碱碱性性缓缓冲冲液液使使氯氯仿仿中中苦苦味味酸酸盐盐解解离离，并并将将苦苦味味酸酸提提取取到到碱碱性性水水溶溶液液中中再进行比色。再进行比色。l c.直直接接在在pH为为45的的缓缓冲冲溶溶液液中中，用用氯氯仿仿提提取取生生物物碱碱苦苦味味酸酸盐盐，将将氯氯仿仿提提取取液液直接进行比色。直接进行比色。3.3.雷氏盐比色法雷氏盐比色法：生生物物碱碱与与雷雷氏氏盐盐生生成成沉沉淀淀后后，将将沉沉淀淀分分离离，溶溶于于丙丙酮酮，于于520520526nm526nm波波长长处处比比色色测测定吸收度，换算生物碱的含量。定吸收度，换算生物碱的含量。生生物物碱碱的的雷雷氏氏盐盐沉沉淀淀的的丙丙酮酮溶溶液液所所呈呈现现的的吸吸收收特特征征，是是由由于于分分子子结结构构中中的的硫硫代代氰氰酸酸铬铬铵铵部部分分，而而不不是是结结合合的的生生物物碱碱部部分分，其其吸吸收值与样品或溶剂无关。收值与样品或溶剂无关。l 硫硫代代氰氰酸酸铬铬铵铵在在丙丙酮酮中中的的克克分分子子吸吸收收系系数数为为106.5(106.5(单单盐盐)或或213.0(213.0(双双盐盐)。故故可可根据其吸收值根据其吸收值A A按下式直接测得样品重按下式直接测得样品重 l W=（A/）MV/1000l 本本方方法法可可不不需需要要标标准准对对照照品品，但但需需注注意意生生物物碱碱生生成成单单盐盐或或双双盐盐，并并要要注注意意样样品品的净化。的净化。(二二)单体生物碱含量测定单体生物碱含量测定 1 1薄层色谱法薄层色谱法 薄薄层层色色谱谱技技术术在在生生物物碱碱类类成成分分分分离离和和测测定定须须结结合合生生物物碱碱的的通通性性选选择择合合适适的的提提取取溶溶剂剂制制成成供供试试品品溶溶液液，需需要要采采用用化化学学方方法法提提取取和和纯纯化化，常常用用液液-液液萃萃取取或或液液-固固萃萃取取，或或结结合合生生物物碱碱的的特特性性进进行行纯纯化化。常常使使用用碱碱性性展展开开剂剂或在碱性气氛中展开或在碱性气氛中展开。在薄层直接扫描定量。在薄层直接扫描定量l时时，须须首首先先作作一一工工作作曲曲线线，目目的的是是考考察察工工作作曲曲线线是是否否为为通通过过原原点点的的直直线线，以以便便决决定定采采用用外外标标一一点点法法或或外外标标两两点点法法进进行行定定量量，其其次次需需要要找找出出线线性性范范围围，以以便便摸摸索索样样品品点点样样量量。采采用用薄薄层层直直接接扫扫描描定定量量还还需需要要随随行行对对照照品品进进行行，同同时时要要考考察察稳稳定定性性，同同板板、异板效应和精密度等。异板效应和精密度等。2 2高效液相色谱高效液相色谱 生生物物碱碱类类成成分分进进行行高高效效液液相相色色谱谱分分析析时时，可可采采用用正正相相、反反相相和和离离子子对对色色谱谱，其其中以反相高效液相色谱应用较多。中以反相高效液相色谱应用较多。为了克服游离硅醇基的影响为了克服游离硅醇基的影响:(1)流动相方面的改进：流动相方面的改进：l a.加加入入硅硅醇醇基基抑抑制制剂剂，最最常常用用的的硅硅醇醇基基抑制剂是三乙胺抑制剂是三乙胺;l b.在流动相中加入离子对试剂在流动相中加入离子对试剂;l c.在在流流动动相相中中加加入入季季铵铵盐盐试试剂剂，例例如如在在水水-甲甲醇醇流流动动相相中中加加入入0.01molL的的溴溴化化四四甲基胺甲基胺。l(2)固定相方面的改进：固定相方面的改进：l 封尾技术可以使填料的检核更彻底。封尾技术可以使填料的检核更彻底。l 键键和和反反应应结结束束后后，用用三三甲甲基基硅硅氯氯烷烷等等进进行行后后续续处处理理，尽尽量量减减少少参参与与羟羟基基，增增加加单体覆盖度。单体覆盖度。第二节第二节黄酮类制剂的分析黄酮类制剂的分析（一）概述（一）概述 黄黄酮酮类类化化合合物物为为自自然然界界广广泛泛存存在在的的一一大大类类化化合合物物，多多具具有有颜颜色色，在在植植物物体体内内大大部部分分与糖结合成甙，一部份以游离形式存在。与糖结合成甙，一部份以游离形式存在。芦丁芦丁(rutin)黄芩苷黄芩苷(baicalin)槲皮素槲皮素(quercetin)l二、结构特征与理化性质二、结构特征与理化性质l（一）结构特征（一）结构特征l 基基本本母母核核为为2苯苯基基色色原原酮酮，现现泛泛指指两两苯苯环环通通过过中中央央三三碳碳链链相相互互联联结结而而成成的的一类化合物。一类化合物。l（二）理化性质（二）理化性质l1.物理性质：多数为结晶性固体物理性质：多数为结晶性固体l2.溶解度溶解度l3.酸碱性：具有酚羟基，显酸性酸碱性：具有酚羟基，显酸性l4.显显色色反反应应：与与分分子子中中酚酚羟羟基基及及-吡吡喃喃酮环酮环有关。有关。l5.紫外吸收紫外吸收I带带带带/nm黄酮、黄酮醇黄酮、黄酮醇330350250270双氢黄酮双氢黄酮310330(弱弱)275290异黄酮异黄酮无无I带吸收带吸收250270查耳酮查耳酮360390240260(较弱较弱)一、定性鉴别一、定性鉴别 定性分析方法主要有定性分析方法主要有 化学显色反应化学显色反应 薄层色谱薄层色谱l(一一)化学显色反应化学显色反应l 1.1.还原反应还原反应 l 盐盐酸酸-镁镁粉粉反反应应显显色色反反应应的的机机理理是是黄黄酮酮类类成成分分经经还还原原反反应应后后生生成成花花色色甙甙元元及及其其二二聚物。聚物。l操作：操作：l 取取样样品品液液5 510mL10mL，加加入入数数滴滴盐盐酸酸，然然后后加加入入少少许许镁镁粉粉，如如果果有有黄黄酮酮、黄黄酮酮醇醇或或其其二二氢氢化化合合物物存存在在，数数分分钟钟后后则则可可产产生生橙橙色或红色。必要时，需作空白试验。色或红色。必要时，需作空白试验。l2与金属盐类试剂的配合反应与金属盐类试剂的配合反应 l 黄黄酮酮类类成成分分能能与与金金属属离离子子如如Al3+，Zr4+等等产产生生络络合合作作用用，产产生生荧荧光光或或颜颜色色加加深深等。等。l 配配合合作作用用的的条条件件是是黄黄酮酮类类成成分分必必须须具具备备下下述述条条件件之之一一者者，即即5-羟羟基基(a)、3-羟羟基基(b)或或邻邻二二酚酚羟羟基基(c)，(a)、(b)都都是是羟羟基基与与4位羰基共同与金属离子形成络合物的。位羰基共同与金属离子形成络合物的。(三三)薄层色谱法薄层色谱法 黄黄酮酮类类成成分分的的薄薄层层定定性性，一一般般采采用用吸吸附附薄薄层层，常常用用的的吸吸附附剂剂有有硅硅胶胶与与聚聚酰酰胺胺，也也有有用用纤纤维维素素、硅硅酸酸镁镁、氧氧化化镁镁。硅硅胶胶色色谱谱分分离离弱弱极极性性化化合合物物较较好好；聚聚酰酰胺胺色色谱谱分分离离含含游游离离酚酚羟羟基基的的黄黄酮酮及及其其甙甙颇颇为为理理想想；而而纤纤维维素素薄薄层层则则适适用用于于分分离离多多糖糖甙甙混混合合物物。展展开开后后的的显显色色反反应应可可采采用用在在紫紫外外光光下下观观察察荧荧光光和和喷喷显显色色剂相配合的方法。剂相配合的方法。l1硅胶薄层色谱硅胶薄层色谱 l 硅硅胶胶分分离离黄黄酮酮成成分分遵遵循循正正相相色色谱谱层层析析规规律律，化化合合物物极极性性越越强强，所所需需溶溶剂剂的的极极性性越大越大。l其其Rf值顺序如下：值顺序如下：l RCH3RHROCH3R-O-糖糖ROHl常用的溶剂系统有：常用的溶剂系统有：l甲甲苯苯-甲甲酸酸乙乙酯酯-甲甲酸酸(5 4 1)，分分离离黄黄酮酮甙元甙元l苯苯-甲醇甲醇(95 5)，分离黄酮甙元；，分离黄酮甙元；l苯苯-甲醇甲醇-乙酸乙酸(35 5 5)，分离黄酮甙；，分离黄酮甙；l氯仿氯仿-甲醇甲醇(8 2)，分离黄酮甙元及甙；，分离黄酮甙元及甙；l苯苯-乙乙酸酸乙乙酯酯(7.5 2.5)或或苯苯-丙丙酮酮(9 1)，分分离离黄黄酮酮甙甙元元衍衍生生物物如如甲甲醚醚或或乙乙酸酸酯酯中中性成分；性成分；l甲甲苯苯-甲甲酸酸乙乙酯酯-甲甲酸酸(5 4 1)，分分离离双双黄黄酮成分。酮成分。l溶溶剂剂系系统统中中各各组组分分的的配配比比可可根根据据薄薄层层色色谱谱的需要加以调整。的需要加以调整。供试液制备供试液制备 取取本本品品粉粉末末0.5g,加加50乙乙醇醇30ml置置水水浴浴上上回回流流30分分钟钟,放放冷冷,滤滤过过,滤滤液液蒸蒸干干乙乙醇醇后后,加加水水少少量量溶溶解解,加加至至聚聚酰酰胺胺小小柱柱上上,先先后后用用水水,乙乙醇醇各各l00ml洗洗脱脱,收收集集乙乙醇醇洗洗脱脱液液,蒸蒸干干,残残渣渣用用乙乙醇醇溶溶解解,使使成成1ml,作作为为供供试试品品溶溶液。液。淫羊藿的鉴别淫羊藿的鉴别例例 对照液制备对照液制备:0.5mg/mL。l薄层板薄层板：硅胶：硅胶G自制板；厚度：自制板；厚度：250ml点样：点样：供试品供试品10L，对照品，对照品2L l展开剂：展开剂：醋酸丁酯醋酸丁酯-甲酸甲酸-水水(1.3 1 1)l展开方式：展开方式：平衡平衡15分钟；上行展开分钟；上行展开8cml显色：显色：l 5%AlCl3乙醇溶液乙醇溶液,紫外光灯下检视。紫外光灯下检视。l色谱识别色谱识别 l 与与淫淫羊羊藿藿甙甙对对照照品品色色谱谱相相应应的的位位置置上上，显相同的黄色荧光斑点。显相同的黄色荧光斑点。l注意事项注意事项 l 温温度度在在2525以以上上；控控制制湿湿度度在在18-4718-47范围内色谱效果较好范围内色谱效果较好.1 2 3 4 5 6 样品：样品：1.1.淫羊藿甙淫羊藿甙 2.2.淫羊藿淫羊藿 3.3.箭叶淫羊藿箭叶淫羊藿 4.4.朝鲜淫羊藿朝鲜淫羊藿 5.5.柔毛淫羊藿柔毛淫羊藿 6.6.巫山淫羊藿巫山淫羊藿 2 2聚酰胺薄层色谱聚酰胺薄层色谱 聚聚酰酰胺胺薄薄层层色色谱谱用用于于分分离离含含游游离离酚酚羟羟基基的的黄黄酮酮甙甙与与甙甙元元较较好好。由由于于各各种种黄黄酮酮类类成成分分取取代代基基团团的的性性质质、多多少少和和位位置置的的不不同同，与与聚聚酰酰胺胺形形成成氢氢键键的的能能力力有有所所差差异异而而得得到到分离。分离。l展开剂中大多含醇展开剂中大多含醇,酸酸,水水,或二者兼有或二者兼有。l常用的溶剂系统有：常用的溶剂系统有：l甲醇甲醇-水水(8 2),分离黄酮甙元及甙，分离黄酮甙元及甙，l乙乙醇醇-水水-乙乙酰酰丙丙酮酮(2 4 1),水水-乙乙醇醇-丁丁酮酮-乙乙酰酰丙丙酮酮(13 3 3 1),苯苯-丁丁酮酮-甲甲醇醇(6 2 2),分离黄酮甙元；分离黄酮甙元；l甲甲酸酸-甲甲醇醇-乙乙酸酸乙乙酯酯(1 21 8),乙乙酸酸-水水(1 2),分离黄酮甙。分离黄酮甙。l鼻炎康片中黄芩甙的薄层色谱鼻炎康片中黄芩甙的薄层色谱l 取取片片剂剂细细粉粉，加加50乙乙醇醇于于60水水浴浴中中热热浸浸30分分钟钟，滤滤过过，取取滤滤液液点点于于聚聚酰酰胺胺薄薄膜膜上上，用用36醋醋酸酸展展开开，以以黄黄芩芩甙甙为为对对照照品品，展展开开后后于于紫紫外外灯灯下下观观察察（365nm)，黄芩甙呈紫色斑点，黄芩甙呈紫色斑点，Rf值约为值约为0.30。3 3纤维素薄层色谱纤维素薄层色谱 用于分离黄酮甙类较好，用于分离黄酮甙类较好，原理与纸色谱相同，原理与纸色谱相同，色谱流动相可用纸色谱所有的流动相。色谱流动相可用纸色谱所有的流动相。l a.黄黄酮酮类类成成分分的的纤纤维维素素色色谱谱行行为为是是：分分子子中中酚酚羟羟基基增增多多时时，无无论论用用上上述述任任意意一一溶溶剂剂系系统统Rf值值均均减减少少；当当分分子子中中羟羟基基为为甲甲基或甲氧基所取代时，基或甲氧基所取代时，Rf值增加，值增加，l b.黄黄酮酮甙甙分分子子中中醇醇羟羟基基增增多多，用用不不同同浓浓度度的的乙乙酸酸展展开开，Rf值值增增加加，而而用用正正丁丁醇醇乙酸水系统则相反。乙酸水系统则相反。二、含量测定二、含量测定 (一一)总黄酮类成分的测定总黄酮类成分的测定 黄黄酮酮类类化化合合物物具具有有特特定定的的紫紫外外吸吸收收带带在在300300400nm,400nm,带带在在240 240 285nm，提提纯纯后后可直接可直接。测定总黄酮时常用芦丁作对照品。测定总黄酮时常用芦丁作对照品。l 在在复复方方制制剂剂中中，由由于于其其他他组组份份吸吸收收干干扰扰，多多需需进进行行显显色色测测定定，以以提提高高本本法法的选择性和灵敏度。的选择性和灵敏度。l 与与金金属属盐盐类类试试剂剂生生成成配配合合物物，常常用用的的是是氯氯盐盐反反应应，试试剂剂为为三三氯氯化化铝铝和和硝硝酸酸铝。铝。l例例:降压丸中芦丁的测定降压丸中芦丁的测定-铝盐络合比色法铝盐络合比色法l标准曲线制备标准曲线制备 l 精精密密吸吸取取一一定定量量的的芦芦丁丁液液分分别别置置于于25ml量量瓶瓶中中,分分别别加加入入5亚亚硝硝酸酸钠钠1.0ml,混混匀匀,放放置置6分分钟钟,加加入入10硝硝酸酸铝铝1.0ml,混混匀匀,放放置置6分分钟钟,加加入入4氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液10.0ml,用用水水稀稀释释至至刻刻度度,混混匀匀,放放置置15分分钟钟,在在500nm处处分分别别测测定定吸吸收收度度.以以吸吸收收度度为为纵纵坐坐标标,对对照品液体积为横坐标绘制标准曲线照品液体积为横坐标绘制标准曲线.l供试品测定供试品测定 l 将将丸丸剂剂粉粉碎碎,精精密密称称取取相相当当于于1.0g槐槐米米的的细细粉粉,置置于于索索氏氏提提取取器器中中,加加入入60ml乙乙醚醚,回回流流至至无无色色,放放冷冷,除除去去乙乙醚醚,再再加加甲甲醇醇60ml,提提取取,放放冷冷.将将提提取取液液转转移移至至100ml量量瓶瓶中中,定定容容.精精密密吸吸取取10m1,置置于于另另一一100ml量量瓶瓶中中,加加水水稀稀释释至至刻刻度度,混混匀匀.精精密密吸吸取取3.0ml于于25ml量量瓶瓶中中，再再按按标标准准曲曲线线项项下下“加加5亚硝酸亚硝酸l钠钠10ml”操操作作，测测定定吸吸收收度度，再再从从标标准准曲曲线线中中查查出出相相当当于于芦芦丁丁对对照照品品液液的的体积，应用下列算式计算芦丁的含量。体积，应用下列算式计算芦丁的含量。l 芦丁芦丁%=VF100%/(3W)（二）单体黄酮成分的含量测定（二）单体黄酮成分的含量测定 (1)(1)薄层色谱法薄层色谱法 薄薄层层色色谱谱法法是是测测定定中中药药制制剂剂中中单单体体黄黄酮酮类类成成分分的的关关键键是是分分离离。样样品品经经有有机机溶溶剂剂或或水水提提取取后后，可可用用硅硅胶胶、纤纤维维素素或或聚聚酰酰胺胺进进行行层层析析，以以达达到到分分离离的的目目的的。层层析析后后可可TLC-TLC-比比色色法测定；也可以用薄层扫描仪直接测定。法测定；也可以用薄层扫描仪直接测定。l实实例例 枳枳实实导导滞滞丸丸中中橙橙皮皮甙甙的的测测定定-荧荧光光薄层扫描法薄层扫描法 l 取取本本品品适适量量，研研细细，取取约约0.5g，精精密密称称定定，置置索索氏氏提提取取器器中中，加加甲甲醇醇90ml，加加热热回回流流4 小小时时，趁趁热热滤滤过过至至100ml 量量瓶瓶中中，用用少少量量甲甲醇醇洗洗涤涤容容器器，洗洗液液与与滤滤液液合合并并，放放冷冷，加加甲甲醇醇至至刻刻度度，摇摇匀匀，精精密密量量取取5ml，置置25ml量量瓶瓶中中，加加甲甲醇醇至至刻刻度度，摇摇匀匀，作为供试品溶液。另橙皮苷对照品作为供试品溶液。另橙皮苷对照品l适适量量，精精密密称称定定，加加甲甲醇醇制制成成每每1ml 含含0.05mg的的溶溶液液，作作为为对对照照品品溶溶液液。照照薄薄层层色色谱谱法法（附附录录 B）试试验验，精精密密吸吸取取供供试试品品溶溶液液5l、对对照照品品溶溶液液2l与与5l，分分别别点点于于同同一一聚聚酰酰胺胺薄薄膜膜上上，以以甲甲醇醇为为展展开开剂剂，展展开开，展展距距约约3cm，取取出出，晾晾干干，喷喷以以 1三三氯氯化化铝铝的的甲甲醇醇溶溶液液，放放置置3 小小时时，在在紫紫外外光光灯灯(365nm)下下定定位位,照照薄薄层层色色谱谱法法（附附录录 B薄层扫描法）进行荧光扫描。薄层扫描法）进行荧光扫描。l激激发发波波长长：330nm,线线性性扫扫描描，测测量量供供试试品品荧荧光光强强度度与与对对照照品品荧荧光光强强度度的的积积分分值值，计算，即得。计算，即得。(2)(2)高效液相色谱法高效液相色谱法 黄酮类成分的黄酮类成分的Np-HPLCNp-HPLC：a.a.无无羟羟基基的的黄黄酮酮类类化化合合物物或或乙乙酰酰化化黄黄酮酮类类化化合合物物，固固定定相相为为硅硅胶胶，流流动动相相可可套套用用薄薄层色谱条件层色谱条件，但极性要相对小一点。，但极性要相对小一点。b.b.乙乙酰酰化化黄黄酮酮、有有一一个个羟羟基基的的黄黄酮酮类类成成分分，采采用用-CN-CN键键合合相相色色谱谱，流流动动相相为为乙乙烷烷-氯氯仿。仿。c.c.含含有有2 2个个以以上上羟羟基基的的黄黄酮酮类类成成分分可可选选用用-NH-NH2 2键键合合相相，流流动动相相可可选选用用二二氧氧六六环环-二二氯甲烷氯甲烷(19)(19)。黄酮类成分的黄酮类成分的Rp-HPLCRp-HPLC：大大多多用用C C1818键键合合相相，流流动动相相常常用用甲甲醇醇-水水-乙酸乙酸(或磷酸缓冲液或磷酸缓冲液)及及乙腈乙腈-水。水。第三节第三节 皂甙类成分的分析皂甙类成分的分析 一、概述一、概述 三萜是由三萜是由30个碳原子组成的萜类化合物个碳原子组成的萜类化合物 可看作由可看作由6个异戊二稀单元联结而成个异戊二稀单元联结而成 具有方面的药理活性具有方面的药理活性 溶于水，振摇后产生气泡溶于水，振摇后产生气泡人参皂苷人参皂苷ReRe(ginsenoside Re)Re)人参皂苷人参皂苷Rg1Rg1(ginsenoside Rg1)Rg1)黄芪甲苷黄芪甲苷(astragaloside IV)甘草酸甘草酸(glycyrrhizic acid)l二、结构特性与理化性质二、结构特性与理化性质l（一）结构特性（一）结构特性l 主要为四环三萜和五环三萜两大类主要为四环三萜和五环三萜两大类l 三三萜萜皂皂苷苷是是由由三三萜萜皂皂苷苷元元和和糖糖、糖糖醛醛酸组成酸组成l 为为化化学学结结构构复复杂杂的的化化合合物物，大大多多数数无无紫外吸收紫外吸收l（二）理化性质（二）理化性质l1.物理性质物理性质l 大多数为白色或无定性粉末大多数为白色或无定性粉末l2.溶解度溶解度l 可可溶溶于于水水，易易溶溶于于热热水水、含含水水稀稀醇醇、热甲醇和热乙醇中，难溶于乙醚、苯等。热甲醇和热乙醇中，难溶于乙醚、苯等。l3.显色反应显色反应l 1醋酐醋酐-浓硫酸反应浓硫酸反应 l 取取含含皂皂甙甙样样品品置置试试管管中中，加加醋醋酐酐1ml1ml溶溶解解后后，沿沿试试管管壁壁加加入入少少量量浓浓硫硫酸酸，在在两两液液层层中中间间出出现现色色环环，甾甾体体皂皂甙甙生生成成蓝蓝色色或或蓝蓝黑黑色色，而三萜皂甙则出现红、粉红或紫色。而三萜皂甙则出现红、粉红或紫色。2 2三氯醋酸反应三氯醋酸反应 取取皂皂甙甙溶溶液液滴滴在在滤滤纸纸条条上上，滴滴三三氯氯醋醋酸酸试试剂剂,加加热热到到6060，若若斑斑点点生生成成红红色色渐渐变变为为紫紫色色,则则样样品品为为甾甾体体皂皂甙甙；若若需需加加热热到到100100才才出现以上颜色变化出现以上颜色变化,则样品为三萜皂甙。则样品为三萜皂甙。3 3氯仿氯仿-浓硫酸反应浓硫酸反应 样样品品溶溶解解于于氯氯仿仿,沿沿管管壁壁滴滴加加浓浓硫硫酸酸后后,在氯仿层呈现红或蓝色在氯仿层呈现红或蓝色,并有绿色荧光出现。并有绿色荧光出现。l4冰醋酸冰醋酸-乙酰氯反应乙酰氯反应 l 样样品品溶溶于于冰冰醋醋酸酸中中，加加入入乙乙酰酰氯氯数数滴滴及及氯氯化化锌锌结结晶晶数数粒粒，稍稍加加热热，则则呈呈现现淡淡红红色或紫红色。色或紫红色。l 5五氯化锑反应五氯化锑反应 l 样品加五氯化锑的氯仿液呈紫蓝色。样品加五氯化锑的氯仿液呈紫蓝色。三、皂甙类成分的定性分析三、皂甙类成分的定性分析 1.1.泡沫反应泡沫反应 取取中中药药材材粉粉末末约约1g,1g,加加水水10ml,10ml,煮煮沸沸1010分分钟钟后后过过滤滤,将将滤滤液液于于试试管管内内强强烈烈振振摇摇,如如产产生生持持久久性性泡泡沫沫(15(15分分钟钟以以上上)即即为为阳阳性性反反应应.所所产产生的泡沫多少与生的泡沫多少与pHpH有关有关,取取2 2支试管支试管,一管加入一管加入 0.1mol/L盐盐酸酸液液5ml，另另一一管管加加入入0.1 mol/L氢氢氧氧化化钠钠液液5ml，再再各各加加入入中中药药水水溶溶液液，使使酸酸管管的的pH为为1，碱碱管管pH为为13，强强烈烈振振摇摇，如如两两管管所所形形成成的的泡泡沫沫高高度度相相同同，则则中中药药中中含含三三萜萜皂皂甙甙，如如碱碱管管泡泡沫沫较较酸酸管管泡泡沫沫高高数数倍，则中药中含甾体皂甙。倍，则中药中含甾体皂甙。3.3.薄层色谱薄层色谱 进进行行薄薄层层分分离离时时采采用用吸吸附附剂剂常常用用的的是是硅硅胶胶或或氧化铝氧化铝以及特殊需要的以及特殊需要的硅藻土硅藻土。亲亲水水性性强强的的皂皂甙甙通通常常要要求求硅硅胶胶的的吸吸附附活活性性较较弱弱些些，展展开开剂剂的的极极性性要要大大些些，才才能能得得到到较较好好的的分分离离效效果果。常常用用的的溶溶剂剂系系统统有有：氯氯仿仿-甲甲醇醇-水水(1372(1372，下下层层)、正正丁丁醇醇-乙乙酸酸乙乙酯酯-水水(415)(415)等。等。l 皂皂甙甙元元的的极极性性较较小小，如如以以硅硅胶胶为为吸吸附附剂剂，展展开开剂剂的的亲亲脂脂性性要要求求强强烈烈，所所用用的的溶溶剂剂系系统统常常以以苯苯、氯氯仿仿、己己烷烷、异异丙丙醚醚等等为为主主要要组组分分,再再加加以以少少量量其其他他极极性性溶溶剂剂。常常用用的的溶溶剂剂系系统统有有环环己己烷烷-乙乙酸酸乙乙酯酯(1 1)、苯苯-乙乙酸酸乙乙酯酯(1 1)、氯氯仿仿-乙乙酸酸乙乙酯酯(1 1)等等l薄层色谱后薄层色谱后,皂甙类化合物常用的显色剂：皂甙类化合物常用的显色剂：l(1)25磷磷钼钼酸酸乙乙醇醇溶溶液液：140加加热热510分分钟钟,皂皂甙甙元元均均呈呈深深蓝蓝色色,灵灵敏敏度度高高,不不易易褪褪色色.l(2)三三氯氯化化锑锑的的浓浓盐盐酸酸或或氯氯仿仿溶溶液液：90烤烤10分分钟钟,应应在在通通风风橱橱中中进进行行,加加热热后后不不同同的的皂甙元显出不同种颜色皂甙元显出不同种颜色,有助于鉴别皂甙元。有助于鉴别皂甙元。l(3)硫硫酸酸-甲甲醇醇(1 1)：喷喷后后加加热热，显显红红褐褐色、紫色、黄色或黑色色、紫色、黄色或黑色,与加热温度有关。与加热温度有关。(4)(4)氯氯磺磺酸酸-乙乙酸酸(12)(12)溶溶液液：喷喷后后130130加加热热5 5分分钟钟，各各种种皂皂甙甙元元显显不不同同颜颜色色，如如天天蓝蓝、紫紫、粉粉红红、淡淡棕棕色色等等，在在紫紫外外光光灯灯下下也也显显不不同同荧荧光光，比比较较灵灵敏敏，可可检检出出1010-1-11010-3-3gg，可用于鉴别和定量。可用于鉴别和定量。(5)(5)碘碘蒸蒸气气：灵灵敏敏度度约约为为1 12g2g，碘碘的的优优点点是是易易挥挥发发，显显色色后后挥挥去去碘碘，斑斑点点可可作作定定量量分分析，常用于确定斑点位置。析，常用于确定斑点位置。l例例 人参人参 三七三七 西洋参西洋参 的薄层鉴别的薄层鉴别l 供供试试液液制制备备:取取本本品品粉粉末末1g，加加氯氯仿仿40ml，置置水水浴浴回回流流1小小时时，弃弃氯氯仿仿液液，药药渣渣挥挥干干，加加水水饱饱和和正正丁丁醇醇10ml，超超声声处处理理30min，取取上上清清，加加氨氨试试液液三三倍倍量量，摇摇匀匀，放放置置分分层层，取取上上层层正正丁丁醇醇液液蒸蒸干干，加加甲甲醇醇溶溶解解制制成成1ml供试液。供试液。对对照照液液制制备备 取取人人参参皂皂甙甙RbRb1 1，RbRb2 2，RcRc，ReRe，RdRd，RgRg1 1，RfRf对对照照品品和和伪伪人人参参皂皂甙甙 F11F11对对照照品品，加加甲甲醇醇制制成成每每lmllml各各含含2mg2mg的的混混合合溶溶液液，作为对照品溶液。作为对照品溶液。薄层板薄层板:硅胶硅胶6060预制板预制板(Merck)(Merck)点样点样:1:1l ll展展开开剂剂:氯氯仿仿-醋醋酸酸乙乙酯酯-甲甲醇醇-水水(15 40 22 10)10以下放置后的下层溶液。以下放置后的下层溶液。l展开方式展开方式:上行展开；展距：上行展开；展距：12-14cml显显色色:10%硫硫酸酸乙乙醇醇溶溶液液，105加加热热数数分分钟钟,置紫外光灯置紫外光灯(365nm)下检视荧光色谱。下检视荧光色谱。l色谱识别色谱识别 l1.人人参参皂皂甙甙Rf为为人人参参含含有有,西西洋洋参参不不含含,可可作作为为人人参与西洋参的区别依据之一参与西洋参的区别依据之一l2西西洋洋参参含含的的人人参参皂皂甙甙Fll,人人参参不不含含,可可作作为为西西洋参的鉴别特征；洋参的鉴别特征；l3.生生晒晒参参与与红红参参之之区区别别,在在于于Rgl以以上上的的“微微量量皂皂甙甙”，红参较生晒参明显。，红参较生晒参明显。l4.三三七七色色谱谱较较简简单单,最最明明显显的的是是Rbl,Re,Rgl三三个个主斑主斑.需注意的是需注意的是Re斑点与三七皂甙斑点与三七皂甙R1重叠。重叠。样样品品：1-21-2生生晒晒参参；3-53-5红红参参；6-96-9朝朝鲜鲜红红参参；10-1210-12西西洋洋参参(进进口口)；13-1413-14西西洋洋参参(国国产产)；1515三三七七；1616人人参参皂皂甙甙对对照照品品Rb1(S1)Rb1(S1)，Rb2(S2)Rb2(S2)，Rc(S3)Rc(S3)，Re(S4)Re(S4)，Rd(S5),Rd(S5),Rg1(S6)Rg1(S6)，Rf(S7)Rf(S7)，Fll(S8)Fll(S8)。四、皂甙类成分的定量分析四、皂甙类成分的定量分析 皂甙类成分的定量分析可分为皂甙类成分的定量分析可分为 总皂苷测定总皂苷测定 皂苷元测定皂苷元测定 单体皂苷测定单体皂苷测定l 总总皂皂甙甙的的含含量量测测定定一一般般需需用用适适当当的的溶溶剂剂提提取取，如如甲甲醇醇(8095)、乙乙醇醇等等，提提取取后后经经分分离离（如如水水饱饱和和的的正正丁丁醇醇萃萃取取，大大孔孔吸吸附附树树脂脂经经处处理理后后溶溶剂剂洗洗脱脱）得得到到总总皂皂甙甙成成分分，再再根根据据皂皂甙甙类类化化合合物物的的各各自自特特征征来来选选择择含含量量测测定定方方法法。最最常常用用的的方方法法是是比色法。比色法。l 皂皂甙甙元元的的含含量量测测定定时时可可按按总总皂皂甙甙的的提提取取分分离离方方法法得得到到总总皂皂甙甙,再再加加酸酸加加热热水水解解,得得到到皂皂甙甙元元,也也可可以以将将样样品品先先行行水水解解,再再用用有机溶剂从水解后的混合液中有机溶剂从水解后的混合液中提取皂甙元提取皂甙元.l 皂皂甙甙元元含含量量的的测测定定方方法法主主要要有有薄薄层层色色谱法、高效液相色谱法和比色法谱法、高效液相色谱法和比色法。l 单单体体皂皂甙甙的的含含量量测测定定方方法法主主要要为为薄薄层层色色谱法和高效液相色谱法谱法和高效液相色谱法。(一一)总皂苷的含量测定总皂苷的含量测定 比色法比色法 常常利利用用皂皂甙甙能能与与某某些些试试剂剂反反应应后后产产生生颜颜色，然后于可见光区进行比色测定色，然后于可见光区进行比色测定.l常用的皂甙显色试剂常用的皂甙显色试剂：l浓浓硫硫酸酸 通通用用试试剂剂，反反应应常常显显黄黄色色，需需在在较较高温度高温度(8090)反应反应3060分钟。分钟。l高氯酸高氯酸:5的皂甙元的皂甙元。l硫酸硫酸-醋酐、硫酸醋酐、硫酸-冰醋酸试剂冰醋酸试剂:甾体皂甙甾体皂甙。l芳芳香香醛醛-硫硫酸酸或或芳芳香香醛醛-高高氯氯酸酸:常常用用的的皂皂甙甙类显色剂类显色剂。l对对-二甲氨基苯甲醛二甲氨基苯甲醛:三萜皂甙三萜皂甙。(二二)三萜皂甙类单体成分含量测定三萜皂甙类单体成分含量测定 1.1.薄层色谱法薄层色谱法 样样品品经经适适当当的的溶溶剂剂提提取取，用用薄薄层层色色谱谱法法分分离离定定量量。定定量量方方法法 可可用用薄薄层层洗洗脱脱-比比色色法法或薄层扫描法。或薄层扫描法。l薄层色谱薄层色谱-比色法的一般步骤比色法的一般步骤：l1.供试品的制备供试品的制备:样品的提取与预处理。样品的提取与预处理。l2.对照品溶液的配制对照品溶液的配制l3.薄层板的制备薄层板的制备l4.点样点样 对照品与供试品交叉点样。对照品与供试品交叉点样。l5.展开：展开：包括预平衡与样品展开包括预平衡与样品展开l6.定位定位：日光下：日光下,紫外灯下观察紫外灯下观察,碘蒸气定位碘蒸气定位.l7.斑点捕集斑点捕集l8.洗洗脱脱与与定定量量：用用合合适适的的溶溶剂剂洗洗脱脱后后加加显显色色剂剂显显色色，或或加加显显色色剂剂显显色色后后离离心心取取上上清清，以以相相同同大大小小的的固固定定相相为为空空白白同同法法操操作作，于于合适波长处比色定量。合适波长处比色定量。薄层扫描法的一般步骤：薄层扫描法的一般步骤：1.1.供试品的制备供试品的制备:包括样品的提取与预处理。包