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常用培养基的制备常用培养基的制备培养基种类培养基种类:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水一、按成份的不同划分一、按成份的不同划分一、按成份的不同划分一、按成份的不同划分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基天然培养基、合成培养基、半合成培养基天然培养基、合成培养基、半合成培养基天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态划分二、按培养基的物理状态划分二、按培养基的物理状态划分二、按培养基的物理状态划分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途划分三、按培养基用途划分三、按培养基用途划分三、按培养基用途划分 基基基基础础础础培培培培养养养养基基基基、加加加加富富富富培培培培养养养养基基基基、鉴鉴鉴鉴别别别别培培培培养养养养基基基基、选选选选择择择择培培培培养基养基养基养基 湿热法湿热法 ：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。热好。热好。热好。高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：1 1 1 1、设备：高压灭菌锅、设备：高压灭菌锅、设备：高压灭菌锅、设备：高压灭菌锅2 2 2 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。所变化。所变化。所变化。3 3 3 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。也可用于玻璃器皿的灭菌。也可用于玻璃器皿的灭菌。也可用于玻璃器皿的灭菌。4 4 4 4、注意事项：、注意事项：、注意事项：、注意事项：1 1 1 1）冷空气彻底排除；）冷空气彻底排除；）冷空气彻底排除；）冷空气彻底排除；2 2 2 2）加水；）加水；）加水；）加水；3 3 3 3）压力降为）压力降为）压力降为）压力降为“0”“0”“0”“0”时方可打开时方可打开时方可打开时方可打开。n n在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见度的关系见表表2 常压蒸汽灭菌：常压蒸汽灭菌：对对对对于于于于不不不不宜宜宜宜用用用用高高高高压压压压蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽灭灭灭灭菌菌菌菌的的的的培培培培养养养养基基基基如如如如明明明明胶胶胶胶培培培培养养养养基基基基、牛牛牛牛乳乳乳乳培培培培养养养养基基基基，含含含含糖糖糖糖培培培培养养养养基基基基等等等等可可可可采采采采用用用用此此此此法法法法。彻彻彻彻底底底底灭灭灭灭菌菌菌菌则则则则采采采采用间歇灭菌方法。用间歇灭菌方法。用间歇灭菌方法。用间歇灭菌方法。煮沸灭菌法：煮沸灭菌法：煮沸灭菌法：煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间适用注射器和解剖器皿，时间适用注射器和解剖器皿，时间适用注射器和解剖器皿，时间1010101015min15min15min15min，超高温杀菌超高温杀菌超高温杀菌超高温杀菌 135-150C135-150C135-150C135-150C和和和和2-8s2-8s2-8s2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。对牛乳和其它液态食品灭菌。对牛乳和其它液态食品灭菌。对牛乳和其它液态食品灭菌。优点优点优点优点 ：保持食品价值和营养成分。保持食品价值和营养成分。保持食品价值和营养成分。保持食品价值和营养成分。过滤除菌：过滤除菌：原理：介质在有压力时阻隔微生物。原理：介质在有压力时阻隔微生物。原理：介质在有压力时阻隔微生物。原理：介质在有压力时阻隔微生物。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：1 1 1 1、压力适当；、压力适当；、压力适当；、压力适当；2 2 2 2、无菌条件下进行；、无菌条件下进行；、无菌条件下进行；、无菌条件下进行；3 3 3 3、防止渗透现象。、防止渗透现象。、防止渗透现象。、防止渗透现象。辐射灭菌：辐射灭菌：原理：原理：原理：原理：紫外线波长在紫外线波长在紫外线波长在紫外线波长在200200200200300nm300nm300nm300nm，具有杀菌作用，以，具有杀菌作用，以，具有杀菌作用，以，具有杀菌作用，以265-266265-266265-266265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。正比。正比。正比。缺点：缺点：缺点：缺点：穿透力不大。距照射物穿透力不大。距照射物穿透力不大。距照射物穿透力不大。距照射物1.2m1.2m1.2m1.2m为宜。为宜。为宜。为宜。应用：应用：应用：应用：无菌室，医院。无菌室，医院。无菌室，医院。无菌室，医院。注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。对眼睛和皮肤有刺激作用。对眼睛和皮肤有刺激作用。对眼睛和皮肤有刺激作用。化学药品灭菌：化学药品灭菌：原理：原理：原理：原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。应用化学制剂破坏细菌代谢机能。应用化学制剂破坏细菌代谢机能。应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；杀菌剂如重金属离子；杀菌剂如重金属离子；杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。注意：注意：注意：注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微以及微以及微以及微 生物所处的环境有关。生物所处的环境有关。生物所处的环境有关。生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：常用化学杀菌剂有：常用化学杀菌剂有：常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸乙醇、醋酸、石碳酸乙醇、醋酸、石碳酸乙醇、醋酸、石碳酸 福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等 分分分分离离离离与与与与纯纯纯纯化化化化：从从从从混混混混杂杂杂杂的的的的微微微微生生生生物物物物群群群群体体体体中中中中获获获获得得得得只只只只含含含含某一种某一种某一种某一种 或某一株微生物的过程。或某一株微生物的过程。或某一株微生物的过程。或某一株微生物的过程。为为为为什什什什么么么么要要要要进进进进行行行行纯纯纯纯培培培培养养养养：平平平平板板板板上上上上的的的的单单单单一一一一菌菌菌菌落落落落并并并并不不不不一定保一定保一定保一定保 证是一种菌。证是一种菌。证是一种菌。证是一种菌。常用的分离、纯化方法：常用的分离、纯化方法：常用的分离、纯化方法：常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法单细胞挑取法、稀释涂布平板法单细胞挑取法、稀释涂布平板法单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法稀释混合平板法、平板划线法稀释混合平板法、平板划线法稀释混合平板法、平板划线法 实验四实验四 微生物的分离、纯化及培微生物的分离、纯化及培养技术养技术稀释涂布平板法稀释涂布平板法 ：步步步步骤骤骤骤：1 1 1 1、倒倒倒倒平平平平板板板板：牛牛牛牛肉肉肉肉膏膏膏膏蛋蛋蛋蛋白白白白胨胨胨胨培培培培养养养养基基基基，高高高高氏氏氏氏I I I I号号号号培培培培养养养养基基基基，查查查查氏氏氏氏培培培培养养养养基基基基冷冷冷冷却却却却至至至至55-6055-6055-6055-60时时时时，混混混混匀匀匀匀后后后后倒倒倒倒平平平平板板板板，牛牛牛牛肉肉肉肉膏膏膏膏蛋蛋蛋蛋白白白白胨胨胨胨培培培培养养养养基倒基倒基倒基倒4 4 4 4皿，高氏皿，高氏皿，高氏皿，高氏I I I I号培养基和查氏培养基各倒号培养基和查氏培养基各倒号培养基和查氏培养基各倒号培养基和查氏培养基各倒3 3 3 3皿。皿。皿。皿。2 2 2 2、制制制制备备备备污污污污水水水水稀稀稀稀释释释释液液液液：10g10g10g10g土土土土样样样样，加加加加入入入入90ml90ml90ml90ml无无无无菌菌菌菌水水水水中中中中，在在在在三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶中中中中振振振振摇摇摇摇20min20min20min20min。取取取取0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 加加加加入入入入盛盛盛盛有有有有4.5ml4.5ml4.5ml4.5ml无无无无菌菌菌菌水水水水的的的的试试试试管管管管中中中中，以此类推，制成不同稀释度。以此类推，制成不同稀释度。以此类推，制成不同稀释度。以此类推，制成不同稀释度。3 3 3 3、涂涂涂涂布布布布：将将将将上上上上述述述述每每每每种种种种培培培培养养养养基基基基平平平平板板板板底底底底面面面面标标标标记记记记稀稀稀稀释释释释度度度度，然然然然后后后后用用用用无无无无菌菌菌菌吸吸吸吸管管管管从从从从最最最最后后后后三三三三种种种种稀稀稀稀释释释释度度度度，即即即即10101010-4-4-4-4、10101010-5-5-5-5和和和和10101010-6-6-6-6的的的的试试试试管管管管中中中中吸吸吸吸取取取取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。对号放入平板上，用玻棒涂布。对号放入平板上，用玻棒涂布。对号放入平板上，用玻棒涂布。4 4 4 4、培培培培养养养养：高高高高氏氏氏氏I I I I号号号号和和和和查查查查氏氏氏氏倒倒倒倒置置置置培培培培养养养养于于于于28282828培培培培养养养养箱箱箱箱中中中中培培培培养养养养3-3-3-3-5days5days5days5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37373737培养培养培养培养1-2days1-2days1-2days1-2days。5 5 5 5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。平板划线法：平板划线法：平板划线法：平板划线法：1 1 1 1、倒倒倒倒平平平平板板板板，标标标标记记记记培培培培养养养养基基基基名名名名称称称称，编编编编号号号号和和和和实实实实验日期。验日期。验日期。验日期。2 2 2 2、划线方法、划线方法、划线方法、划线方法 稀释混合平板法稀释混合平板法稀释混合平板法稀释混合平板法 ：1 1 1 1、先加菌、先加菌、先加菌、先加菌2 2 2 2、倒平板时注意培养基温度、倒平板时注意培养基温度、倒平板时注意培养基温度、倒平板时注意培养基温度3 3 3 3、混合均匀、混合均匀、混合均匀、混合均匀 微生物培养技术微生物培养技术1 1、斜面接种、斜面接种2 2、液体培养基接种、液体培养基接种3 3、穿刺接种、穿刺接种将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培养箱养箱中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置44冰箱中冰箱中保存。保存。观察菌落形态并记录观察菌落形态并记录序号序号 来源来源 大小大小 形状形状 边缘边缘 颜色颜色 表面表面 代谢物代谢物 种类种类实验五：放线菌及霉菌形态观察目的要求目的要求1.1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。2.2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。作方法。3.3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。初步了解放线菌、霉菌的形态特征。原理原理放线菌是一群丝状，放线菌是一群丝状，G G+的细菌，在气生菌的细菌，在气生菌丝末端形成孢子。丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pHpH与细菌与细菌相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。其其DNA DNA 碱基组成中碱基组成中GCGC含量特别高。超过任含量特别高。超过任何已知的细菌。何已知的细菌。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。放线菌放线菌(Actinomycetes)分生孢子丝分生孢子丝琼脂表琼脂表面面基内菌丝基内菌丝气生菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）（基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝）（气生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）（分生孢子）分生孢子丝分生孢子丝琼脂表琼脂表面面基内菌丝基内菌丝气生菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）（基内菌丝）and aerial mycelium（气（气生菌丝）生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）（分生孢子）n n放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。的重要依据。放线菌的菌落早期绒状同细放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。链霉菌的各种链霉菌的各种孢子丝结构孢子丝结构链霉菌的分离链霉菌的分离：pH中性偏碱 喜干（含水少）采用含各种无机盐的选择性培养基已知放线菌能够产生500多种抗生素。大多数抗生素对不同的细菌有独特的疗效有50多种被实际应用Antibiotics放线菌放线菌Actinomycetes 霉菌(molds)n n是丝状真菌的总称是丝状真菌的总称是丝状真菌的总称是丝状真菌的总称,即即即即“发霉的真菌发霉的真菌发霉的真菌发霉的真菌”。通常指菌丝体比。通常指菌丝体比。通常指菌丝体比。通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下大量生长繁殖。大量生长繁殖。大量生长繁殖。大量生长繁殖。形态特征（Morphological characteristics）n n属异养型真核生物，具有丝状或管状结构，单个分支称为菌丝。菌丝形成的网络状结构称为菌丝体。n n营养菌丝（营养菌丝（vegetative myceliumvegetative mycelium）：汲取营养）：汲取营养n n气生菌丝（气生菌丝（aerial myceliumaerial mycelium）n n繁殖菌丝繁殖菌丝:孢子丝，进行繁殖。孢子丝，进行繁殖。分类（classification）n n有隔菌丝：有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，在菌丝生长过程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂，胞，在菌丝生长过程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂，每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之间的物质相互沟通。如曲霉和青霉。间的物质相互沟通。如曲霉和青霉。n n无隔菌丝：菌丝中无横膈膜，整个细胞是一个单细胞，：菌丝中无横膈膜，整个细胞是一个单细胞，菌丝内有许多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质体菌丝内有许多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质体质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。(1)nonseptate(2)septate繁殖方式繁殖方式n n无性繁殖：无性繁殖：n n芽生孢子芽生孢子n n节孢子节孢子n n孢囊孢子孢囊孢子n n后垣孢子后垣孢子n n分生孢子分生孢子n n有性繁殖：有性繁殖：n n卵孢子卵孢子n n接合孢子接合孢子n n子囊孢子子囊孢子Sporangiospores 孢囊孢子（Sporangiospores are formed within a sporangium）节孢子Arthrospores分生孢子分生孢子ConidiosporesConidiospores卵孢子卵孢子（OosporesOospores）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOospores formation接合孢子接合孢子 ZygosporesZygospores接合孢子接合孢子形成过程形成过程子囊孢子子囊孢子 AscosporesAscospores几种常见霉菌几种常见霉菌属属主要特征主要特征分布分布作用与用途作用与用途根霉属根霉属菌丝无隔菌丝无隔,单细胞单细胞迅速蔓延迅速蔓延,有假根有假根,孢子囊呈黑色孢子囊呈黑色,产生孢子囊和接产生孢子囊和接合孢子合孢子常长在淀粉类食常长在淀粉类食品上如馒头、面品上如馒头、面包、甘薯等包、甘薯等能将淀粉转化为能将淀粉转化为糖，用于生产糖糖，用于生产糖化酶，酿造甜酒化酶，酿造甜酒等等曲霉属曲霉属菌丝分隔，分生菌丝分隔，分生孢子梗顶端膨大，孢子梗顶端膨大，顶囊上生辐射状顶囊上生辐射状小梗菌落疏松、小梗菌落疏松、颜色多样颜色多样空气、谷物、土空气、谷物、土壤和各种有机物壤和各种有机物上上分解淀粉和蛋白分解淀粉和蛋白质能力强，用于质能力强，用于制曲、制醋、生制曲、制醋、生产柠檬酸、酶制产柠檬酸、酶制剂及糖化饲料等剂及糖化饲料等青霉属青霉属菌丝分隔，孢子菌丝分隔，孢子梗呈扫帚形，菌梗呈扫帚形，菌落由紧密到疏松，落由紧密到疏松，多呈蓝绿色多呈蓝绿色空气、土壤及物空气、土壤及物品上，腐烂的柑品上，腐烂的柑橘上更多橘上更多青霉素产生菌，青霉素产生菌，也用于制备农用也用于制备农用抗生素和发酵饲抗生素和发酵饲料料根霉 根霉的形态结构根霉的形态结构曲霉曲霉曲霉的形态结构曲霉的形态结构左侧分生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具左侧分生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具 有二层小梗有二层小梗 青霉青霉 青霉的形态结构青霉的形态结构 A A单轮型单轮型 B B非对称型非对称型 C C对称二轮型对称二轮型实验内容实验内容n人们设计了各种培养和观察方法，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌和霉菌自然生长状态下保持放线菌和霉菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。的形态特征。本实验采用插片法。n n插片法插片法:倒平板倒平板插片插片接种接种培养培养镜镜检检记录绘图记录绘图 n n压印法压印法:倒平板倒平板划线接种划线接种挑取菌落挑取菌落加盖玻片加盖玻片镜检镜检记录绘图记录绘图n n 埋片法埋片法:倒琼脂倒琼脂切槽切槽接种接种培养培养镜检镜检记录绘图记录绘图 n n倒平板倒平板倒平板倒平板 将培养基熔化后，倒将培养基熔化后，倒将培养基熔化后，倒将培养基熔化后，倒10-1210-1210-1210-12毫升左右于灭菌培养皿毫升左右于灭菌培养皿毫升左右于灭菌培养皿毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用内，凝固后使用内，凝固后使用内，凝固后使用.n n插片插片插片插片 将灭菌的盖玻片以将灭菌的盖玻片以将灭菌的盖玻片以将灭菌的盖玻片以45454545度角插入培养皿内的培养基度角插入培养皿内的培养基度角插入培养皿内的培养基度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为中，插入深约为中，插入深约为中，插入深约为1/21/21/21/2或或或或1/31/31/31/3。n n 接种与培养接种与培养接种与培养接种与培养 用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置放置放置放置28282828培养培养培养培养3 3 3 37 7 7 7天。天。天。天。n n 观察观察观察观察 培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。放于载玻片上。直接在显微镜下观察。放于载玻片上。直接在显微镜下观察。放于载玻片上。直接在显微镜下观察。关键步骤及注意事项关键步骤及注意事项n n倒平板要厚一些，接种时划线要密。倒平板要厚一些，接种时划线要密。n n插片时要有一定角度并与划线垂直。插片时要有一定角度并与划线垂直。n n观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。适当视野，更换高倍镜观察。n n如果用如果用0.1%0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。色后观察，效果会更好。思考题思考题n n镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝气生菌丝?n n你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？么？实验六、菌种保藏实验六、菌种保藏 几种常用的保藏方法：几种常用的保藏方法：几种常用的保藏方法：几种常用的保藏方法：1 1 1 1、传代培养法、传代培养法、传代培养法、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置（用于厌氧细菌）培养好后，置（用于厌氧细菌）培养好后，置（用于厌氧细菌）培养好后，置4C4C4C4C 冰箱中存放冰箱中存放冰箱中存放冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。，定期进行传代培养、再存放。，定期进行传代培养、再存放。，定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。液体石蜡来进一步延长保存期。液体石蜡来进一步延长保存期。液体石蜡来进一步延长保存期。2 2 2 2、载体法、载体法、载体法、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上使生长合适的微生物吸附在一定的载体上使生长合适的微生物吸附在一定的载体上使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。进行干燥。进行干燥。进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。麸皮、磁珠和滤纸片等。麸皮、磁珠和滤纸片等。麸皮、磁珠和滤纸片等。3 3 3 3、悬液法、悬液法、悬液法、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4 4 4 4、冷冻法、冷冻法、冷冻法、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。法和液氮法。法和液氮法。法和液氮法。此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。率及保护剂的使用。率及保护剂的使用。率及保护剂的使用。5 5 5 5、真空干燥法、真空干燥法、真空干燥法、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和L L L L干燥法。干燥法。干燥法。干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。冻，然后在低温状态下进行减压干燥。冻，然后在低温状态下进行减压干燥。冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-L-L-L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在1010101020C20C20C20C 范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。操作方法操作方法 1 1 1 1、斜面保藏法、斜面保藏法、斜面保藏法、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置（棉塞换成胶塞效果更好），置（棉塞换成胶塞效果更好），置（棉塞换成胶塞效果更好），置4C4C4C4C 冰箱中包冰箱中包冰箱中包冰箱中包藏。藏。藏。藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存线菌及芽孢菌保存线菌及芽孢菌保存线菌及芽孢菌保存2 2 2 24 4 4 4个月移种一次，酵母菌个月移种一次，酵母菌个月移种一次，酵母菌个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。传代一次。传代一次。传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是此法优点是操作简单、使用方便，缺点是此法优点是操作简单、使用方便，缺点是此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。保藏时间短、易被污染。保藏时间短、易被污染。保藏时间短、易被污染。2 2、液体石蜡保藏法、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端其用量以高出斜面顶端1CM1CM为准，使菌种为准，使菌种与空气隔绝。与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1 12 2年，普通细菌也可保藏年，普通细菌也可保藏1 1年左右。年左右。3 3、穿刺保藏法、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置后用胶塞封严，置44冰箱存放。冰箱存放。4 4 4 4、砂土管保藏法、砂土管保藏法、砂土管保藏法、砂土管保藏法 （1 1 1 1）河砂处理）河砂处理）河砂处理）河砂处理 取河砂若干加入盐酸取河砂若干加入盐酸取河砂若干加入盐酸取河砂若干加入盐酸10%10%10%10%，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸，加热煮沸30min30min30min30min除去除去除去除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40404040目筛子过筛，弃去目筛子过筛，弃去目筛子过筛，弃去目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。粗颗粒，备用。粗颗粒，备用。粗颗粒，备用。（）土壤处理（）土壤处理（）土壤处理（）土壤处理 取取取取非非非非耕耕耕耕作作作作层层层层不不不不含含含含腐腐腐腐殖殖殖殖质质质质的的的的痩痩痩痩黄黄黄黄土土土土或或或或红红红红土土土土，加加加加自自自自来来来来水水水水浸浸浸浸泡泡泡泡洗洗洗洗涤涤涤涤数数数数次次次次，直直直直至至至至中中中中性性性性。烘烘烘烘干干干干后后后后碾碾碾碾碎碎碎碎，用用用用100100100100目目目目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。(3)(3)(3)(3)砂土混合砂土混合砂土混合砂土混合 处处处处理理理理妥妥妥妥当当当当的的的的河河河河砂砂砂砂与与与与土土土土壤壤壤壤按按按按3 3 3 3：1 1 1 1的的的的比比比比例例例例掺掺掺掺合合合合(或或或或根根根根据据据据需需需需要要要要而而而而用用用用其其其其他他他他比比比比例例例例，甚甚甚甚至至至至可可可可全全全全部部部部作作作作砂砂砂砂或或或或土土土土)均均均均匀匀匀匀后后后后，装装装装入入入入10 x100mm10 x100mm10 x100mm10 x100mm的的的的小小小小试试试试管管管管或或或或安安安安瓿瓿瓿瓿管管管管中中中中，每每每每管管管管分分分分装装装装1g1g1g1g左左左左右右右右，塞塞塞塞上上上上棉棉棉棉塞塞塞塞，进进进进行行行行灭灭灭灭菌菌菌菌(通通通通常常常常采采采采用用用用间间间间歇歇歇歇灭灭灭灭菌菌菌菌2-32-32-32-3次次次次)，最最最最后烘干。后烘干。后烘干。后烘干。(4)(4)(4)(4)无菌检查无菌检查无菌检查无菌检查 每每每每10101010支支支支砂砂砂砂土土土土管管管管随随随随机机机机抽抽抽抽1 1 1 1支支支支，将将将将砂砂砂砂土土土土倒倒倒倒入入入入肉肉肉肉汤汤汤汤培培培培养养养养基基基基中中中中，30303030培培培培养养养养40h40h40h40h，若若若若发发发发现现现现有有有有微微微微生生生生物物物物生生生生长长长长，所所所所有有有有砂砂砂砂土土土土管管管管则则则则需需需需重重重重新新新新灭灭灭灭菌菌菌菌，再再再再作作作作无无无无菌菌菌菌试试试试验，直至证明无菌后方可使用。验，直至证明无菌后方可使用。验，直至证明无菌后方可使用。验，直至证明无菌后方可使用。(5)(5)(5)(5)菌悬液的制备菌悬液的制备菌悬液的制备菌悬液的制备 取取取取生生生生长长长长健健健健壮壮壮壮的的的的新新新新鲜鲜鲜鲜斜斜斜斜面面面面菌菌菌菌种种种种，加加加加入入入入2-3ml2-3ml2-3ml2-3ml无无无无菌菌菌菌水水水水(每每每每18x180mm 18x180mm 18x180mm 18x180mm 的的的的试管斜面菌种试管斜面菌种试管斜面菌种试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。(6)(6)(6)(6)分装样品分装样品分装样品分装样品 每每每每支支支支砂砂砂砂土土土土管管管管(注注注注明明明明标标标标记记记记后后后后)加加加加入入入入0 0 0 05ml5ml5ml5ml菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液(刚刚刚刚刚刚刚刚使使使使砂砂砂砂土土土土润润润润湿湿湿湿为为为为宜宜宜宜)，用接种针拌匀。用接种针拌匀。用接种针拌匀。用接种针拌匀。(7)(7)(7)(7)干燥干燥干燥干燥 将将将将装装装装有有有有菌菌菌菌悬悬悬悬液液液液的的的的砂砂砂砂土土土土管管管管放放放放入入入入干干干干燥燥燥燥器器器器内内内内，干干干干燥燥燥燥器器器器底底底底部部部部盛盛盛盛有有有有干干干干燥燥燥燥剂剂剂剂。用真空泵抽干水分后火焰封口用真空泵抽干水分后火焰封口用真空泵抽干水分后火焰封口用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。(8)(8)(8)(8)保存保存保存保存 置置置置4444冰冰冰冰箱箱箱箱或或或或室室室室温温温温干干干干燥燥燥燥处处处处，每每每每隔隔隔隔一一一一定定定定的的的的时时时时间间间间进进进进行行行行检检检检测测测测。此此此此法法法法多多多多用用用用于于于于产产产产芽芽芽芽孢孢孢孢的的的的细细细细菌菌菌菌、产产产产生生生生孢孢孢孢子子子子的的的的霉霉霉霉菌菌菌菌和和和和放放放放线线线线菌菌菌菌。在在在在抗抗抗抗生生生生素素素素工工工工业业业业生生生生产产产产中中中中应应应应用广泛、用广泛、用广泛、用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。5 5、冷冻真空干燥法、冷冻真空干燥法 （1 1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。（2 2）菌种培养：细菌