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细胞培养小技巧 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望基础篇基础篇-无菌操作基本技术无菌操作基本技术 n n1.1.1.1.实验进行前，无菌室及无菌操作台实验进行前，无菌室及无菌操作台实验进行前，无菌室及无菌操作台实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow)(laminar flow)(laminar flow)(laminar flow)以紫外灯照射以紫外灯照射以紫外灯照射以紫外灯照射30-60 30-60 30-60 30-60 分钟灭菌，以分钟灭菌，以分钟灭菌，以分钟灭菌，以70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 10 10 10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以物品带出工作台，以物品带出工作台，以物品带出工作台，以70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转操作台运转操作台运转操作台运转10 10 10 10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。n n2.2.2.2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以流通。实验用品以流通。实验用品以流通。实验用品以70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。n n3.3.3.3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约45 45 45 45 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。n n4.4.4.4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台级之无菌操作台级之无菌操作台级之无菌操作台(至少至少至少至少Class II)Class II)Class II)Class II)。操作过程中，应避免引起。操作过程中，应避免引起。操作过程中，应避免引起。操作过程中，应避免引起aerosol aerosol aerosol aerosol 之产生，小心毒性药品，例如之产生，小心毒性药品，例如之产生，小心毒性药品，例如之产生，小心毒性药品，例如DMSO DMSO DMSO DMSO 及及及及TPA TPA TPA TPA 等，并避免尖锐针头之伤等，并避免尖锐针头之伤等，并避免尖锐针头之伤等，并避免尖锐针头之伤害等。害等。害等。害等。n n5.5.5.5.定期检测下列项目：定期检测下列项目：定期检测下列项目：定期检测下列项目：5.1.CO2 5.1.CO2 5.1.CO2 5.1.CO2 钢瓶之钢瓶之钢瓶之钢瓶之CO2 CO2 CO2 CO2 压力压力压力压力 5.2.CO2 5.2.CO2 5.2.CO2 5.2.CO2 培养箱之培养箱之培养箱之培养箱之CO2 CO2 CO2 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染浓度、温度、及水盘是否有污染浓度、温度、及水盘是否有污染浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用水盘的水用水盘的水用水盘的水用无菌水，每周更换无菌水，每周更换无菌水，每周更换无菌水，每周更换)。5.3.5.3.5.3.5.3.无菌操作台内之无菌操作台内之无菌操作台内之无菌操作台内之airflow airflow airflow airflow 压力，定期更换紫外线灯管及压力，定期更换紫外线灯管及压力，定期更换紫外线灯管及压力，定期更换紫外线灯管及HEPA HEPA HEPA HEPA 过过过过滤膜，预滤网滤膜，预滤网滤膜，预滤网滤膜，预滤网(300(300(300(300小时小时小时小时/预滤网，预滤网，预滤网，预滤网，3000 3000 3000 3000 小时小时小时小时/HEPA)/HEPA)/HEPA)/HEPA)。n n6.6.6.6.水槽可添加消毒剂水槽可添加消毒剂水槽可添加消毒剂水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)(Zephrin 1:750)(Zephrin 1:750)(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。，定期更换水槽的水。，定期更换水槽的水。，定期更换水槽的水。基础篇基础篇-实验用品实验用品 n n1.1.种类种类种类种类 1.1.1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与与与与pasteurpipetpasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。外，其它均为塑料无菌制品。外，其它均为塑料无菌制品。外，其它均为塑料无菌制品。1.2.TC1.2.TC级培养盘表面均有级培养盘表面均有级培养盘表面均有级培养盘表面均有coatingcoating高分子物高分子物高分子物高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有质以让细胞吸附，培养容器种类有质以让细胞吸附，培养容器种类有质以让细胞吸附，培养容器种类有TflaskTflask，plates,dishes,rollerbottleplates,dishes,rollerbottle等，依实验需等，依实验需等，依实验需等，依实验需要使用。要使用。要使用。要使用。1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,51.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25mlml,10ml,25ml1.4.1.4.塑料离心管塑料离心管塑料离心管塑料离心管:15ml,50ml:15ml,50ml，均有，均有，均有，均有22种不种不种不种不同材质，其中同材质，其中同材质，其中同材质，其中polypropylene(PP)polypropylene(PP)为不透明为不透明为不透明为不透明材质，材质，材质，材质，polystyrene(PS)polystyrene(PS)为透明材质，可依为透明材质，可依为透明材质，可依为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。实验需要而选择适合材质之离心管。实验需要而选择适合材质之离心管。实验需要而选择适合材质之离心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽，用以抽，用以抽，用以抽掉废弃培养液等。掉废弃培养液等。掉废弃培养液等。掉废弃培养液等。1.6.1.6.玻璃血清瓶玻璃血清瓶玻璃血清瓶玻璃血清瓶(PyrexorDuran(PyrexorDuranglassware)glassware)：100ml,250ml,500100ml,250ml,500ml,1000mlml,1000mln n2.2.清洗清洗清洗清洗 2.1.2.1.新购玻璃血清瓶先以新购玻璃血清瓶先以新购玻璃血清瓶先以新购玻璃血清瓶先以0.10.05NHCl0.10.05NHCl浸泡数浸泡数浸泡数浸泡数小时，洗净后才开始使用。小时，洗净后才开始使用。小时，洗净后才开始使用。小时，洗净后才开始使用。2.2.2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。n n3.3.灭菌灭菌灭菌灭菌 3.1.3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌灭菌灭菌灭菌121121,15lb,20,15lb,20分钟，置于分钟，置于分钟，置于分钟，置于ovenoven中烘干。中烘干。中烘干。中烘干。3.2.3.2.实验用玻璃实验用玻璃实验用玻璃实验用玻璃pasteurpipetpasteurpipet以干热灭菌以干热灭菌以干热灭菌以干热灭菌170170,4,4小时。小时。小时。小时。3.3.3.3.液体或是固体废弃物可用液体或是固体废弃物可用液体或是固体废弃物可用液体或是固体废弃物可用10%10%hypochloridehypochloride溶液溶液溶液溶液(次氯酸，即漂白水次氯酸，即漂白水次氯酸，即漂白水次氯酸，即漂白水)或是蒸汽或是蒸汽或是蒸汽或是蒸汽高压灭菌高压灭菌高压灭菌高压灭菌121121,15lb,20,15lb,20分钟处理。分钟处理。分钟处理。分钟处理。基础篇基础篇-培养基培养基 n n1.1.液体培养基贮存于液体培养基贮存于液体培养基贮存于液体培养基贮存于4 4 冰箱，避免光照，实验进行冰箱，避免光照，实验进行冰箱，避免光照，实验进行冰箱，避免光照，实验进行前放在前放在前放在前放在3737 水槽中温热。水槽中温热。水槽中温热。水槽中温热。n n2.2.液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基(加血清加血清加血清加血清)存放期为六个月，期间存放期为六个月，期间存放期为六个月，期间存放期为六个月，期间glutamineglutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量加适量加适量加适量glutamineglutamine。n n3.3.粉末培养基配制粉末培养基配制粉末培养基配制粉末培养基配制(以以以以11升为例升为例升为例升为例)：3.1.3.1.细胞培养基通常须添加细胞培养基通常须添加细胞培养基通常须添加细胞培养基通常须添加10%10%血清，因此粉末培血清，因此粉末培血清，因此粉末培血清，因此粉末培养基之配制体积为养基之配制体积为养基之配制体积为养基之配制体积为900ml900ml，pHpH为为为为7.2-7.47.2-7.4。NaHCO3NaHCO3为另外添加，若将为另外添加，若将为另外添加，若将为另外添加，若将NaHCO3NaHCO3粉末直接加入粉末直接加入粉末直接加入粉末直接加入液体培养基中会造成液体培养基中会造成液体培养基中会造成液体培养基中会造成pHpH之误差，或局部过碱。因此粉之误差，或局部过碱。因此粉之误差，或局部过碱。因此粉之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及末培养基及末培养基及末培养基及NaHCO3NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后粉末应分别溶解后才混合，然后粉末应分别溶解后才混合，然后粉末应分别溶解后才混合，然后用用用用CO2CO2气体调整气体调整气体调整气体调整pHpH，而非用强酸，而非用强酸，而非用强酸，而非用强酸(HCl)(HCl)或强碱或强碱或强碱或强碱(NaOH)(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的的的的pHpH易发生改变。易发生改变。易发生改变。易发生改变。n n3.2.3.2.材料：材料：材料：材料：纯水纯水纯水纯水(milli-Q(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)，粉末，粉末，粉末，粉末培养基培养基培养基培养基，NaHCO3NaHCO3，电磁搅拌器，电磁搅拌器，电磁搅拌器，电磁搅拌器 无菌血清瓶无菌血清瓶无菌血清瓶无菌血清瓶，0.10.1或或或或0.20.2mmmm无菌过滤膜无菌过滤膜无菌过滤膜无菌过滤膜，pHpH计，真空泵，计，真空泵，计，真空泵，计，真空泵，CO2CO2气体气体气体气体 n n3.3.3.3.步骤：步骤：步骤：步骤：3.3.1.3.3.1.取粉末培养基溶于取粉末培养基溶于取粉末培养基溶于取粉末培养基溶于700mlmilli-Q700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶水中，搅拌使其溶水中，搅拌使其溶水中，搅拌使其溶解。解。解。解。3.3.2.3.3.2.称取适量之称取适量之称取适量之称取适量之NaHCO3NaHCO3粉末溶于粉末溶于粉末溶于粉末溶于200mlmilli-Q200mlmilli-Q水中，水中，水中，水中，搅拌使其溶解，然后通入搅拌使其溶解，然后通入搅拌使其溶解，然后通入搅拌使其溶解，然后通入CO2CO2气体至饱和，约气体至饱和，约气体至饱和，约气体至饱和，约3-53-5分钟。分钟。分钟。分钟。3.3.3.3.3.3.将溶解且含饱和将溶解且含饱和将溶解且含饱和将溶解且含饱和CO2CO2之之之之NaHCO3NaHCO3溶液加入溶解之液体溶液加入溶解之液体溶液加入溶解之液体溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之培养基中混合。混后溶液之培养基中混合。混后溶液之培养基中混合。混后溶液之pHpH应为应为应为应为7.2-7.47.2-7.4，除非，除非，除非，除非pHpH值偏差值偏差值偏差值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2CO2气气气气体调整体调整体调整体调整pHpH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pHpH会升高会升高会升高会升高0.1-0.1-0.20.2。3.3.4.3.3.4.以以以以0.10.1或或或或0.2mm0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 4。(血清血清血清血清亦可加入培养基中一起过滤亦可加入培养基中一起过滤亦可加入培养基中一起过滤亦可加入培养基中一起过滤)3.3.5.3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。附附-配制培养基之生长测试配制培养基之生长测试 n n材料：材料：材料：材料：MDCKcell(ATCCCCL-34MDCKcell(ATCCCCL-34或或或或CCRC60004)CCRC60004)6-wellTCplate(or35mmTCdish)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolmethanolglacialaceticacidglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)n n步骤：步骤：步骤：步骤：1.1.以待测试培养基培养以待测试培养基培养以待测试培养基培养以待测试培养基培养MDCKcellMDCKcell，接种，接种，接种，接种MDCKMDCK细胞于细胞于细胞于细胞于6-wellplate6-wellplate(或或或或35mmTCdish)35mmTCdish)中，每个中，每个中，每个中，每个wellwell接种接种接种接种11021102活细胞，同时作对照活细胞，同时作对照活细胞，同时作对照活细胞，同时作对照组实验。组实验。组实验。组实验。2.2.接种接种接种接种5 577天后，在天后，在天后，在天后，在100100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。3.3.去除培养基，加入去除培养基，加入去除培养基，加入去除培养基，加入1mlCarnoys1mlCarnoys固定液固定液固定液固定液(甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸3:1)3:1)，室温，室温，室温，室温下静置下静置下静置下静置10min10min。4.4.去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。5.5.加入加入加入加入1ml10%Giemsasolution1ml10%Giemsasolution，室温下静置染色，室温下静置染色，室温下静置染色，室温下静置染色2-3min2-3min。6.6.去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。7.7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。佳，则丢弃之。佳，则丢弃之。佳，则丢弃之。基础篇基础篇-抗生素抗生素 n n1.1.细胞库之细胞培养基不加抗生素细胞库之细胞培养基不加抗生素细胞库之细胞培养基不加抗生素细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1.1.1.培养自培养自培养自培养自ATCCATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生引进之细胞株，培养基中不加抗生引进之细胞株，培养基中不加抗生引进之细胞株，培养基中不加抗生素。素。素。素。1.2.1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作培养自其它实验室引进之细胞株，制作培养自其它实验室引进之细胞株，制作培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokentokenfreezefreeze前培养基须添加抗生素，待前培养基须添加抗生素，待前培养基须添加抗生素，待前培养基须添加抗生素，待tokenfreezetokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。n n2.2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个寄送活细胞时，须将培养液充满整个寄送活细胞时，须将培养液充满整个寄送活细胞时，须将培养液充满整个flaskflask时，则时，则时，则时，则须添加抗生素须添加抗生素须添加抗生素须添加抗生素(penicillin100units/ml+(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)streptomycin100ug/ml)。n n3.3.若要检测若要检测若要检测若要检测mycoplasmamycoplasma，则培养基内不可添加，则培养基内不可添加，则培养基内不可添加，则培养基内不可添加gentamicingentamicin，因，因，因，因gentamicingentamicin会抑制会抑制会抑制会抑制mycoplasmamycoplasma生长。生长。生长。生长。n n4.4.去除细菌污染之抗生素混合配方去除细菌污染之抗生素混合配方去除细菌污染之抗生素混合配方去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/mlbacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。，注意混合使用后药物毒性会增强。，注意混合使用后药物毒性会增强。，注意混合使用后药物毒性会增强。n n5.5.抗生素使用种类与浓度：抗生素使用种类与浓度：抗生素使用种类与浓度：抗生素使用种类与浓度：工作浓度工作浓度工作浓度工作浓度.储存温度储存温度储存温度储存温度.杀灭细菌杀灭细菌杀灭细菌杀灭细菌 penicillin100units/ml-20penicillin100units/ml-20G(+)G(+)bacteriabacteriastreptomycin100ug/ml-20streptomycin100ug/ml-20G(+)andGG(+)andG(-)bacteria(-)bacteriachlotetracycline50ug/ml-20chlotetracycline50ug/ml-20G(+)G(+)andG(-)bacteriaandG(-)bacteriagentamicin50ug/ml-20gentamicin50ug/ml-20G(+)andGG(+)andG(-)bacteria,mycoplasma(-)bacteria,mycoplasmaamphotericinB2.5ug/ml-20amphotericinB2.5ug/ml-20yeastandyeastandmoldsmoldsnystatin50ug/ml-20nystatin50ug/ml-20yeastandyeastandmoldsmoldsfungizone2.5ug/ml-20fungizone2.5ug/ml-20yeastandyeastandmoldsmolds基础篇基础篇-血清血清 n n1.1.血清必须贮存于血清必须贮存于血清必须贮存于血清必须贮存于2020-70-70，若存放于，若存放于，若存放于，若存放于4 4，请，请，请，请勿超过一个月。如果一次无法用完一勿超过一个月。如果一次无法用完一勿超过一个月。如果一次无法用完一勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将瓶，可将瓶，可将瓶，可将40404545mlml分装于无菌分装于无菌分装于无菌分装于无菌50ml50ml离心管中，由于血清结冻时体离心管中，由于血清结冻时体离心管中，由于血清结冻时体离心管中，由于血清结冻时体积会增加约积会增加约积会增加约积会增加约10%10%，必须预留此膨胀体积之空间，否必须预留此膨胀体积之空间，否必须预留此膨胀体积之空间，否必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。则易发生污染或容器冻裂之情形。则易发生污染或容器冻裂之情形。则易发生污染或容器冻裂之情形。n n2.2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。过滤，勿直接过滤血清。过滤，勿直接过滤血清。过滤，勿直接过滤血清。n n3.3.瓶装瓶装瓶装瓶装(500ml)(500ml)血清解冻步骤血清解冻步骤血清解冻步骤血清解冻步骤(逐步解冻法逐步解冻法逐步解冻法逐步解冻法):-20):-20或或或或7070至至至至4 4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以一般以一般以一般以50ml50ml无菌离心管可分装无菌离心管可分装无菌离心管可分装无菌离心管可分装404045ml45ml。在溶解。在溶解。在溶解。在溶解过程中须规则摇晃均匀过程中须规则摇晃均匀过程中须规则摇晃均匀过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡小心勿造成气泡小心勿造成气泡小心勿造成气泡)，使温度与成，使温度与成，使温度与成，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由分均一，减少沈淀的发生。勿直接由分均一，减少沈淀的发生。勿直接由分均一，减少沈淀的发生。勿直接由2020直接至直接至直接至直接至3737解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。发生沈淀。发生沈淀。发生沈淀。n n4.heat-inactivation4.heat-inactivation是指是指是指是指5656,30,30分钟加热已分钟加热已分钟加热已分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份理之目的是使血清中之补体成份理之目的是使血清中之补体成份理之目的是使血清中之补体成份(complement)(complement)去活化。去活化。去活化。去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolyticactivities,contractionofsmoothcytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltypeoflymphocyticandmacrophagecelltype。n n5.5.勿将血清置于勿将血清置于勿将血清置于勿将血清置于3737太久，若在太久，若在太久，若在太久，若在3737放置太久，血清放置太久，血清放置太久，血清放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。受到破坏，而影响血清之品质。受到破坏，而影响血清之品质。受到破坏，而影响血清之品质。n n6.6.血清之沈淀物血清之沈淀物血清之沈淀物血清之沈淀物 6.1.6.1.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白血清中之脂蛋白血清中之脂蛋白血清中之脂蛋白(lipoprotein)(lipoprotein)变性及解冻后血清中变性及解冻后血清中变性及解冻后血清中变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白存在之血纤维蛋白存在之血纤维蛋白存在之血纤维蛋白(fibrin)(fibrin)造成，这些凝絮沈淀物不造成，这些凝絮沈淀物不造成，这些凝絮沈淀物不造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心可用离心可用离心可用离心3000rpm,5min3000rpm,5min去除，或离心后上清液去除，或离心后上清液去除，或离心后上清液去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。n n6.2.6.2.显微镜下观察之显微镜下观察之显微镜下观察之显微镜下观察之“小黑点小黑点小黑点小黑点”：通常经过热处理之：通常经过热处理之：通常经过热处理之：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是微镜下观察像是微镜下观察像是微镜下观察像是“小黑点小黑点小黑点小黑点”，常会误认为血清遭受污，常会误认为血清遭受污，常会误认为血清遭受污，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在染，而将血清放在染，而将血清放在染，而将血清放在3737中欲培养此中欲培养此中欲培养此中欲培养此“微生物微生物微生物微生物“，但在，但在，但在，但在3737环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。附附-血清之生长测试血清之生长测试 n n材料：材料：材料：材料：MDCKcell(ATCCCCL-34MDCKcell(ATCCCCL-34或或或或CCRC60004)CCRC60004)a-MEM(alphamodifiedminimalessentiala-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)medium,GibcoBRL12000-022)6-wellTCplate(or35mmTCdish)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolmethanolglacialaceticacidglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)n n步骤：步骤：步骤：步骤：1.1.以以以以a-MEMwith10%FBS(a-MEMwith10%FBS(已测试过已测试过已测试过已测试过)培养培养培养培养MDCKMDCK细胞细胞细胞细胞于于于于T75flaskT75flask至至至至80%confluency80%confluency。2.2.以以以以trypsin-EDTAtrypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之处理细胞，离心后，加入适量不加血清之处理细胞，离心后，加入适量不加血清之处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEMa-MEM制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-a-MEMMEM稀释细胞浓度为稀释细胞浓度为稀释细胞浓度为稀释细胞浓度为11021102活细胞数活细胞数活细胞数活细胞数/ml/ml。3.3.将将将将1ml1ml细胞悬浮液接种入细胞悬浮液接种入细胞悬浮液接种入细胞悬浮液接种入6-wellplate6-wellplate中，并另加入中，并另加入中，并另加入中，并另加入11mlml含不同浓度的血清含不同浓度的血清含不同浓度的血清含不同浓度的血清(20%,10%,4%,2%,1%,(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)0.4%)之之之之a-MEMa-MEM，使血清最终浓度为，使血清最终浓度为，使血清最终浓度为，使血清最终浓度为10%,5%,2%,10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%1%,0.5%,0.2%。用已测试过之血清同时进行对照组试。用已测试过