最新实验一---DNA提取PPT课件.ppt
实验一实验一-DNA-DNA提取提取实验原理实验原理植植物物DNA的的分分离离是是分分子子生生物物学学、遗遗传传学学和和育育种种学学等等植植物物科科学学研究的基础要求。对研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：提取一般有三个要求：1.DNA的纯度可以满足下游操作的要求的纯度可以满足下游操作的要求2.DNA必须完整必须完整3.DNA应当有足够的量应当有足够的量一一般般来来说说,构构建建基基因因组组文文库库,初初始始DNA长长度度必必须须在在100kb以以上上,否否则则酶酶切切后后两两边边都都带带合合适适末末端端的的有有效效片片段段很很少少。而而进进行行RFLP和和PCR分分析析,DNA长长度度可可短短至至50kb，在在该该长长度度以以上上，可可保保证证酶酶切切后后产产生生RFLP片片段段(20kb以以下下)，并并可可保保证证包包含含PCR所扩增的片段所扩增的片段(一般一般2kb以下以下)。如如果果对对植植物物进进行行大大规规模模筛筛选选，操操作作程程序序应应当当快快捷捷，简简便便，价价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料：新鲜植物组织。实验材料：新鲜植物组织。100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)50mmol/L EDTA500 mmol/L NaCl1.5%SDSDNA提取缓冲液提取缓冲液实验所需试剂：实验所需试剂：24:1/氯仿氯仿:戊醇戊醇其它试剂：液氮、其它试剂：液氮、TE缓冲液，无缓冲液，无水乙醇、水乙醇、70%乙醇。乙醇。2CTAB buffer 100mM Tris pH8.0 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH8.0 2%CTAB 0.2%巯基乙醇巯基乙醇酚酚/氯仿（氯仿（1:1）氯仿：氯仿：50 ml无水乙醇无水乙醇蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）或）或氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。RNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大分子来消除大分子的的RNARNA。酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。材料。多糖提取液中加多糖提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA纯化（去杂质）纯化（去杂质）PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化。2-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。适用于提取新鲜植物以及干品、冷冻品的基因组DNA。实验仪器实验仪器实验步骤：实验步骤：1.取新鲜叶片约取新鲜叶片约3g,剪碎剪碎,加入液氮充分研磨后转移至加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；离心管中；2.在在65预热的提取液中按预热的提取液中按3.8g/L加入加入Na Bisufite,混匀并调混匀并调pH至至8.0；3.在管中加入适量提取液，在管中加入适量提取液，60水浴保温约水浴保温约30min，不时颠倒混匀；，不时颠倒混匀；4.冷却至室温后加入等体积氯仿冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右；左右；5.室温下室温下10000rpm离心离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，积的冷酒精，-20 放置放置1h或过夜；或过夜；6.挑出挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量适量70%酒精，摇动洗涤酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤，重复洗涤2-3次；次；7.吹干吹干DNA，加入适量，加入适量TE在在65溶解，完全溶解后离心去除杂质；溶解，完全溶解后离心去除杂质；8.加入加入RNase（10mg/mL）,室温处理室温处理0.5-1h,除去除去RNA，4或或-20贮存。贮存。9.如需纯化如需纯化DNA，再加入适量，再加入适量TE，氯仿，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加异戊醇多次抽提后吸取上清，加入入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇，和两倍体积的乙醇，-20 放置放置1h或过夜；或过夜；10.吹干沉淀后，加入适量吹干沉淀后，加入适量TE，65溶解，溶解，4或或-20贮存。贮存。1.植物叶子约植物叶子约3g,剪碎置剪碎置预冷预冷研钵中研钵中 加入液氮充分研磨，加入液氮充分研磨，注意不能干磨注意不能干磨3.3.60水浴保温水浴保温30-60min加入等体积氯仿，用力摇匀加入等体积氯仿，用力摇匀6.6.再次再次10000rpm离心离心5min；将上清小心吸入新的离心管中；将上清小心吸入新的离心管中；DNA样品在样品在0.9%Agarose胶上电泳（例图）胶上电泳（例图）实验注意事项实验注意事项1.微微量量移移液液枪枪的的使使用用一一定定要要规规范范，吸吸取取氯氯仿仿等等有有机机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；试剂要注意不要将试剂吸入枪中；2.提提取取过过程程中中的的机机械械力力可可能能使使大大分分子子DNA断断裂裂成成小小片片段段，所所以以为为保保证证DNA的的完完整整性性，各各步步操操作作均均应应较温和，避免剧烈震荡。较温和，避免剧烈震荡。3.尽尽量量取取材材幼幼嫩嫩组组织织，最最好好在在早早晨晨取取材材，可可以以避避免免过多的糖分污染过多的糖分污染Email：课后要求：完成实验报告注意：实验目的，实验原理，实验步骤，你的实验材料，结果，实验中出现的问题以及你的分析。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！21
