病理生理教研室.ppt

病理生理教研室 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望细胞凋亡细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程化疗药物诱导的细胞凋亡细胞凋亡的过程不同于坏死性死亡，其染色质断裂，细胞核碎裂程核裂片，细胞质浓缩，细胞体积减小，细胞膜内折，整个细胞通过起泡和发芽方式形成大小不等凋亡小体。凋亡的细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间，因此产生的断裂DNA在电泳时会呈180-200bp整数倍大小的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。能诱导细胞凋亡的枉法有很多，这里主要采取化疗药物诱导细胞凋亡化疗药物诱导细胞凋亡并产生“阶梯”效应实验材料HepG2 肝癌细胞株，DNA提取试剂盒，移液器，EP管，PBS，低温离心机实验步骤1.在细胞悬液中加入20 l Proteinase K溶液，混匀。2.加入200 l缓冲液GB，充分颠倒混匀，70放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除水珠。3.加人200 l 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(13,400g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。5.向吸附柱CB3中加入500 l缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(13,400g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。实验步骤6.向吸附柱CB3中加入600 l 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm(13,400g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7.重复操作步骤6。8.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(13,400g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9.吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 l洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm(13,400g)离心 2 min，将溶液收集到离心管中。讨论DNA提取过程中哪些步骤会导致样品不纯，为什么？化疗药物诱导细胞凋亡的机制是什么？