体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证培训资料.ppt

体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证1.为什么要对生物样品进行处理？为什么要对生物样品进行处理？2.有哪些生物样品？有哪些生物样品？3.有哪些样品处理方法？各自的特点。有哪些样品处理方法？各自的特点。4.如何对分析方法进行验证？如何对分析方法进行验证？5.有哪些参考标准？有哪些参考标准？2 生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。6全血不易保存，且血细胞中含有更多的干扰物质，影响测定，故很少采用全血测定药物浓度。仅适用于血浆药物浓度太低或者血浆药物浓度波动大，且难以控制的药物如：环孢霉素A。7测定血中药物浓度血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。将采取的血液置含有抗凝剂抗凝剂（如：肝素、EDTA）的试管中，混合后，3000至4000 r/min离心，分离血细胞，上清液即为血浆。8血浆中含有的物质种类和比例血浆中含有的物质种类和比例9 血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置15-30 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白，更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。10 一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20的条件，长期保存时可以保存在-80的条件下，是生物样品检测中最常用的样本。11尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了保存，常会加入防腐剂。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢物及其缀合物等形式排出。尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。12唾液中所含成分比较简单，且容易获得，但是只有少数药物的唾液浓度和血浆游离药物浓度具有相关性，实际使用不多，当药物血浆结合率高的时候，唾液中药物的浓度极低，很难检测。13采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短期保存，可 4冷藏；长期保存，可-20冷冻，不要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂酶抑制剂和抗氧化剂抗氧化剂。生物样品的保存：生物样品的保存：生物样品的保存：生物样品的保存：14主要应考虑生物样品的种类生物样品的种类，被测药物的性质被测药物的性质和测定方法测定方法三个方面的问题。1.1.沉淀蛋白沉淀蛋白 PPTPPT2.2.液液萃取液液萃取 LLELLE3.3.固相萃取固相萃取 SPESPE15有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙乙睛睛、甲醇、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。16实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶剂，涡旋离心后，取上清进样；若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影响很大；常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。17优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。18 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率较高。加入中性盐加入中性盐1920加入强酸加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%10%三三氯氯醋醋酸酸等。血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。20 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04-Na2W04,ZnS0ZnS04 4-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。加入锌盐或铜盐沉淀剂加入锌盐或铜盐沉淀剂21在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酶水解的方法。酶解法酶解法22超速离心法平衡透析法最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的血浆蛋白结合率。23 药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物，有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。2.2.液液萃取法液液萃取法 LLELLE24有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿丁基甲醚和氯仿等。应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性有机溶剂的特性、药物的特点、药物的特点、有机溶剂相和水相的体积比有机溶剂相和水相的体积比及水相的水相的pHpH值值等。酸性药物的解离：AH+H2O A-+H+碱性药物的解离：B+H2O B+OH-药物的解离常数pKa为药物解离50%时溶液的pH值。25药物的提取程度主要取决于水相的pH值。对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa 1-2个单位；对于酸性药物来说，则要低于pKa值1-2个单位；这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中。常用来调节pH值的物质有：甲酸、乙酸、盐酸 或 氨水、氢氧化钠等。水相的水相的水相的水相的PHPH值值值值-影响液液萃取最关键的因素影响液液萃取最关键的因素影响液液萃取最关键的因素影响液液萃取最关键的因素26具体的提取模式有两种，直接提取和反提取法。优点：样品经过提取后，可除去大部分杂质，比较“干净”；对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩；大多数药物具有脂溶性，应用范围广。缺点：费时费力，操作繁琐；且对血浆进行提取时，血浆中的脂质脂质会一起被提取出，当使用质谱检测器时，会当使用质谱检测器时，会在离子源处产生在离子源处产生基质效应基质效应基质效应基质效应，严重干扰质谱检测结果的准，严重干扰质谱检测结果的准确性！确性！27方法摸索中，一般是使用以上溶剂，平行操作，同时提取，附加空白对照，比对结果，判断哪种有机溶剂的提取效果最好；若均不理想，可以再混合使用以上溶剂，调整比例1:1,1:2,1:3的使用；在摸索合适的提取溶剂同时，可根据药物的酸碱性尝试着添加些酸、碱或者离子对试剂，提高回收率；提取过程中，一定要严控pH值，对于两性药物则需要使用缓冲溶液保证提取回收率的稳定可重现。28举例：雌二醇的检测举例：雌二醇的检测 取血浆样品100uL，+同位素内标20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80冷冻10min，倒出上层有机层，40水浴氮气吹干，+150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40水浴孵育20min，+磷酸盐缓冲液2mL+叔丁基甲醚4mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80冷冻10min，倒出上层有机层，40水浴氮气吹干，流动相复溶。29 固 相 萃 取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。3.3.固相萃取固相萃取 SPESPE30 固相萃取的基本原理和方法：固相萃取的基本原理和方法：固相萃取的基本原理和方法：固相萃取的基本原理和方法：SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。3132萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！33固相萃取操作一般有五步：固相萃取操作一般有五步：活化活化甲醇甲醇/乙腈乙腈 润湿小柱，活化填料；润湿小柱，活化填料；平衡平衡水或适当缓冲液冲洗平衡小柱；水或适当缓冲液冲洗平衡小柱；上样上样将样品转移上柱，抽去废液；将样品转移上柱，抽去废液；淋洗淋洗水或缓冲液最大程度洗去干扰物；水或缓冲液最大程度洗去干扰物；洗脱洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。341.1.正相色谱原理正相色谱原理2.2.反相色谱原理反相色谱原理3.3.离子交换原理离子交换原理根据原理分类：根据原理分类：3536SPESPE方法的优点：方法的优点：1.不会发生乳化；2.适用范围广；3.提取效率高；4.方便快速，可以一次提取分离多种化合物；5.溶剂消耗少；6.易于实现自动化；7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的依据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最大限度的分离出药物，去除干扰。目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已经广泛应用。37三种方法的比较：三种方法的比较：38将药物进行化学衍生化的目的是：使药物变成具有能被分离的性质；提高检测的灵敏度；增强药物的稳定性；提高对光学异构体分离的能力等。药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如：-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。4.4.化学衍生化法化学衍生化法39HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化，影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺等。40定量下限达定量下限达定量下限达定量下限达10 10 10 10 pgpg级别！级别！级别！级别！41待待测药物的理化性物的理化性质及在生物体内的存在状况及在生物体内的存在状况分析分析测定的目的与要求定的目的与要求生物生物样品的品的类型与型与预处理方法理方法实验室条件室条件体内药物分析方法的建立体内药物分析方法的建立421.光谱分析法2.色谱法色谱法色谱法色谱法 3.毛细管电泳法4.免疫分析法免疫分析法免疫分析法免疫分析法 5.同位素法体内药物分析方法大致可归为一下几类：体内药物分析方法大致可归为一下几类：43体内药物的体内药物的体内药物的体内药物的HPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MSHPLC-MS/MS分析方法开发的一般流程：分析方法开发的一般流程：分析方法开发的一般流程：分析方法开发的一般流程：1.查阅相关文献资料，了解药物的理化性质，选定内标物质；2.使用标准品，扫描质谱条件；3.选择色谱柱和流动相，摸索合适的液相条件；4.依据样品基质，配制模拟生物样品，选择相应的样品处理 方法，处理后进样分析；5.调整样品处理方法或液相条件，并可进一步优化质谱参数；6.根据检测目的，设定定量范围，对方法进行考察。44方法学验证方法学验证（validation）生物样品测定的关键是方法学的确证。生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果，因此必须对所建立的方法进行验证。并且在实际样品检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。45HPLC-MS/MSHPLC-MS/MS方法方法检测检测的的的的验证验证内容：内容：1.特异性和灵敏度特异性和灵敏度2.标准曲线和线性范围标准曲线和线性范围3.批内精密度和准确度批内精密度和准确度4.批间精密度和准确度批间精密度和准确度5.稀释效应稀释效应6.定量下限定量下限7.回收率回收率 8.基基质质效效应应9.残留效残留效应应10.稳稳定性（定性（标标准溶液准溶液稳稳定性、定性、融解融解样样品品稳稳定性、定性、长长期期稳稳定性、定性、冻冻/融循融循环稳环稳定性、定性、进样进样器中器中样样品品稳稳定性等定性等）化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则46Guideline on bioanalytical method validation-EMEA1.1.选择性选择性选择性选择性 SelectivitySelectivity考察方法：测定至少六份不同来源的合适的空白生物基质结果要求：在化合物出峰位置，干扰成分的信号大小不 得超过定量下限中分析物信号高度的20%；在 内标的出峰位置，杂质响应不得超过内标信 号的5%。472.2.残留效应残留效应残留效应残留效应 Carry-overCarry-over考察方法：跟在最高浓度的样品之后，连续进样三遍空 白样品 ULOQ-Blank-ULOQ-Blank-ULOQ-Blank结果要求：空白样品中分析物的信号应小于定量下限中分 析物信号的20%；内标的信号应小于5%。483.3.定量下限定量下限定量下限定量下限 Lower Limit of quantification LLOQLower Limit of quantification LLOQ考察方法：连续测定六份定量下限浓度的样品，统计准 确度和精密度结果要求：准确度应在80%-120%之间；精密度结果小 于20%；同时定量下限处信号响应值应至少 为空白样品的5倍。494.4.校正曲线校正曲线校正曲线校正曲线 Calibration curve Calibration curve 结果要求：校正曲线应至少包括六个浓度点以及一个Matrix Blank 和一个 Control Zero 点（仅作参考，不纳入校正曲线的计算），必要时可以做双份测定；各个浓度点的准确度应在85%-115%之间，精密度应小于15%，定量下限处为80%-120%和20%；对不符合要求的浓度点可以排除计算，但至少有75%以上的浓度点符合要求；方法验证期间应至少提供三条以上的合格的标准曲线纳入统计。505.5.准确度准确度准确度准确度 AccuracyAccuracy考察方法：测定四个浓度的QC样品，分别为LLOQ，low QC，medium QC，high QC，每个浓度至少测定5份；结果要求：批内批内批内批内：每个浓度QC样品测定结果的均值应在理论 浓度的85%-115%之间，LLOQ处在80%-120%之间；批间批间批间批间：至少两天测定至少三批QC样品，每个浓度 QC样品测定结果的总平均值应在理论浓度的85%-115%之间，LLOQ处在80%-120%之间。51质控样品质控样品质控样品质控样品 Quality ControlQuality Control，QC QC 将标准品加入到生物基质中配制成的模拟生物样品，用作方法学验证中的考察样品和样品测定中的方法学质控。低浓度质控低浓度质控 (Low QC)(Low QC)浓度不超过LLOQ的3倍；中间浓度质控中间浓度质控(Medium QC)(Medium QC)浓度一般为定量范围的中间浓度；高浓度质控高浓度质控(High QC)(High QC)浓度至少为ULOQ的75%。质控样品推荐由独立人员一次性配制，进样分析合格后分装，冰冻储存，每次取足够数量的样品使用，剩余丢弃。526.6.精密度精密度精密度精密度 PrecisionPrecision 考察方法：测定四个浓度的QC样品，分别为LLOQ，low QC，medium QC，high QC，每个浓度至少测定5份；结果要求：批内批内批内批内：统计每个浓度QC样品测定结果间的CV%值 应小于15%，LLOQ处小于20%；批间批间批间批间：统计每个浓度所有QC样品测定结果间的 CV%值应小于15%，LLOQ处小于20%。537.7.稀释完整性稀释完整性稀释完整性稀释完整性 Dilution integrityDilution integrity考察方法：将5倍于ULOQ浓度的QC样品，使用空白基质连 续稀释。每个浓度单独单独单独单独稀释，至少测定5份样品；结果要求：每个稀释浓度的准确度偏差和精密度应在15%之内。548.8.稳定性稳定性稳定性稳定性 StabilityStability8.1分析物和内标的标准贮备液(Stock)和标准工作液(Working)的稳定性8.2样品冰冻/融三次解稳定性，Freeze/Thaw，F/T8.3样品融解后短期稳定性，Thawed8.4样品冰冻的长期稳定性，Long-term8.5处理后样品溶液在进样器中的稳定性55 稳定性考察内容和操作主要是根据样品的实际储存条件设计，所考察的冻/融循环数和储存时间均应相等或超过实际样品。标准溶液稳定性考察应将stock solution稀释至合适的浓度范围之内，结果新/旧两份标准溶液的Diff%值应在5%之内。样品的稳定性应使用Low和High浓度的QC样品进行考察，每个浓度测定三份，结果的均值与理论浓度的DEV%值应在15%之内。569.9.基质效应基质效应基质效应基质效应 Matrix effectMatrix effect考察方法：在LQC和HQC两个浓度基础上，取至少6份不 同来源的空白生物基质，提取后加入标准和内 标溶液做为考察组；对照组使用不含有基质的 纯溶液，浓度相当于加入的LQC和HQC的浓度；计算基质效应因子MF和内标校正的MF。结果要求：内标校正的MF的CV%值应不大于15%。5758绝对基质效应绝对基质效应绝对基质效应绝对基质效应考察方法：a组：使用基质基质基质基质配制三个浓度的QC样品，各 测定三份；b组：使用溶剂溶剂溶剂溶剂配制三个浓度的QC样品，各 测定三份；结果要求：绝对基质效应=响应值a/响应值b*100%；各浓度质控的分析物和内标的绝对基质效应均 值在85%-115%之间，相对标准偏差小于15%。目前国内的主流的基质效应考察方法：目前国内的主流的基质效应考察方法：目前国内的主流的基质效应考察方法：目前国内的主流的基质效应考察方法：59相对基质效应相对基质效应相对基质效应相对基质效应考察方法：使用6份不同来源的生物基质，测定LLOQ，每 份基质重复测定3份；结果要求：准确度应在80%-120%之间；每个基质至少有 2个符合要求算合格；6批基质中，至少有5批 合格算通过。60提取回收率提取回收率提取回收率提取回收率 RecoveryRecovery考察方法：a组：测定三个浓度的QC样品各六份，流动 相复溶；b组：使用等量空白基质代替QC样品，共测 定18份，提取后吹干，使用等体积的折算后 相当于QC浓度的溶液复溶；结果要求：计算3个浓度的QC样品的CV%值应小于15%。61举例：地西泮举例：地西泮HPLC-MS/MS分析方法验证报告分析方法验证报告62样品分析中应注意的问题：样品分析中应注意的问题：样品分析中应注意的问题：样品分析中应注意的问题：1.1.1.1.实验中的样品编号问题实验中的样品编号问题实验中的样品编号问题实验中的样品编号问题2.2.2.2.分析批的概念分析批的概念分析批的概念分析批的概念3.3.3.3.色谱响应值计算问题色谱响应值计算问题色谱响应值计算问题色谱响应值计算问题63谢谢 谢！谢！64结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！65