体内药物分析课件教学提纲.ppt

体内药物分析ppt课件体内药物分析概述一、体内药物分析的定义 研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质和量变化规律的分析方法学。药物分析,法医鉴定,毒物分析 分析目标三、体内药物分析的对象Company LCompany LCompany Logo四、体内药物分析的特点1干扰杂质多(内源性物质,分离纯化)2样品浓度低(富集,净化)3取样量少4工作量大5时间短6有一定设备五、体内药物分析方法n1.色谱分析法：TLC、GC、HPLC、HPCEn2.免疫分析法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等n3.生物学方法：微生物学方法用于抗生素类药物的体内分析，如生物利用度，生物等效性或临床TDM等体内样品测定 第一节第一节 常用体内样品的制备与贮藏常用体内样品的制备与贮藏一、生物样品的采集与贮藏 体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。12（一）样品的采集1血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血血液2尿样目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离优点：易得，属非损伤性取样，样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。缺点：与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。3唾液 唾液是无损伤性采样，易唾液是无损伤性采样，易采集采集。一些药物的唾液药浓（一些药物的唾液药浓（S S）与）与血浆游离药浓血浆游离药浓(P)(P)密切相关，因此，在密切相关，因此，在TDMTDM中可利用测定中可利用测定S S代替代替P P监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。优点：不受时间和地点的限制，可反复采集，采集时无痛苦、无感染危险；唾液成分比血液、尿液简单，提取方便，有时可直接上样测定；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。缺点：唾液是各腺体分泌的的混合液体，其组成发生经时变动。S/P只有少数药物是恒定值。蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度低。对有些患者（昏迷）不能采集唾液样品。16（二）样品的贮藏1血样（血浆、血清）及时分离冷藏，-70加入稳定 剂NaF2尿样 尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变3唾液：同血样第二节第二节 生物样品的预处理与制备生物样品的预处理与制备30%以上工作和费用用在样品前处理上以上工作和费用用在样品前处理上18二、生物样品的预处理（一）预处理的目的（一）预处理的目的n将药物从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物的总浓将药物从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物的总浓度度n将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出来将微量药物从复杂的介质中纯化、富集出来（分离浓缩）n防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度和选择性等（防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度和选择性等（出现浑浊和沉淀，杂质多，与试剂起反应，影响色谱柱寿命）（二）处理方法选择的一般原则1药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性2浓度范围 灵敏的方法3测定的目的 定性 定量 母体 代谢4生物样品的种类5样品处理与分析方法的选择 专一性 灵敏性处理步骤与方法处理步骤与方法全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取放射免疫分析残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS常用体内样品预处理方法常用体内样品预处理方法蛋白质的去除加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)缀合物的水解酸水解(盐酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有机破坏(硝酸-高氯酸消化)分离、纯化与浓集液-液萃取法 (Liquid-Liquid Extraction,LLE)液-固萃取法 (Liquid-Solid Extraction,LSE)溶解剂法(硝酸-高氯酸消化)常用体内样品预处理方法常用体内样品预处理方法Company Logo（三）生物样品去蛋白处理目的：去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能，延长使用期限1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl2加入酸性沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点3组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化4其他 加热 超滤（四）生物样品缀合物水解1酸水解：0.1mol/L HCl，100，30min，条件较剧烈，易致药物分解，空白值也高。2酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37数小时，条件温和，选择性强，但费用较高。3溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解。为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：为测定尿液中药物总量，要将缀合物水解：（五）超滤分离法Company Logo（六）化学衍生法Company Logo（五）分离、纯化与浓集（五）分离、纯化与浓集 有有差别差别才有可能分离！才有可能分离！生物样品含有大量可影响测定的内源生物样品含有大量可影响测定的内源性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时性杂质，加上服用的药物、代谢物、同时服用的其他药物，组成一个极其复杂的混服用的其他药物，组成一个极其复杂的混合物。合物。如何将微量的药物从如此复杂的混合如何将微量的药物从如此复杂的混合物中分离出来？物中分离出来？31生物样品的萃取优点：与杂质分离简便 浓集 提取率高1、液液萃取法、液液萃取法原理：多数药物是亲脂性的原理：多数药物是亲脂性的，在适当的有，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而生物样品中的大多数而生物样品中的大多数内源性杂质是强极内源性杂质是强极性的水溶性物质（性的水溶性物质（差别）差别）。因而用有机溶。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量剂萃取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后测定。的样品中提取药物经浓集后测定。采用采用LLE要考虑的几个问题要考虑的几个问题（1）溶剂的选择与纯度要求）溶剂的选择与纯度要求 纯度纯度AR以上以上 了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相溶原则选用溶原则选用对药物的未电离分子可溶，而对电对药物的未电离分子可溶，而对电离形式的分子不溶（光谱分析法）离形式的分子不溶（光谱分析法）沸点低、易沸点低、易挥发、浓集挥发、浓集与水不相混溶与水不相混溶无毒，不易燃烧无毒，不易燃烧不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）具有较具有较高的化学稳定性和惰性高的化学稳定性和惰性不影响紫外测定不影响紫外测定毒性大的尽量不用毒性大的尽量不用33（3）水相的）水相的PH值值 主要由药物的主要由药物的pKa决定！决定！（2）有机溶剂相和水相的体积比）有机溶剂相和水相的体积比 1 1或或2 1 由实际情况决定，文献中有的由实际情况决定，文献中有的10 1以上以上生物样品一般多在碱性下提取！生物样品一般多在碱性下提取！34由于血药浓度较低，提取时需浓集由于血药浓度较低，提取时需浓集 传统的浓集方法主要有两种：一种是在传统的浓集方法主要有两种：一种是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。供测定。另一种是挥去提取溶剂后，再用少量适另一种是挥去提取溶剂后，再用少量适合的溶剂溶解后测定。合的溶剂溶解后测定。35 衡量提取方法优劣的一个重要指标就衡量提取方法优劣的一个重要指标就是提取回收率，它是指药物从生物样品中是提取回收率，它是指药物从生物样品中被分离出来用于测定的比例，一般应高于被分离出来用于测定的比例，一般应高于60%-乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80%药物的萃取药物的萃取36文献上常提到的文献上常提到的LLE的缺点的缺点 传统萃取方式回收率低、样品用传统萃取方式回收率低、样品用量大、繁琐费时、溶剂用量大、溶剂量大、繁琐费时、溶剂用量大、溶剂毒性大、易乳化、不能自动化操作毒性大、易乳化、不能自动化操作37 关于固相萃取小柱：a.常见的固相萃取柱分为三部分：医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板(20m)和填料(多为40-60m，80-100m)。b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml为例：其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。2.固相萃取(Solid Phase Extraction，简称，简称SPE)法38SPE填料填料亲脂型亲脂型:大孔吸附树脂，亲脂性键合硅胶。大孔吸附树脂，亲脂性键合硅胶。亲水型：硅胶、硅藻土。亲水型：硅胶、硅藻土。离子交换：苯磺酸基，羧基等。离子交换：苯磺酸基，羧基等。39固相萃取操作一般有五步：固相萃取操作一般有五步：活化活化甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一定的溶剂环境。定的溶剂环境。平衡平衡水或适当缓冲液冲洗小柱。水或适当缓冲液冲洗小柱。上样上样将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。弃去废液保留在柱上。弃去废液淋洗淋洗水或缓冲液最大程度除去干扰物。水或缓冲液最大程度除去干扰物。洗脱洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。亲脂性亲脂性键合相硅胶键合相硅胶SPE柱的实验步骤：柱的实验步骤：4041亲水型填料亲水型填料 用作用作SPE的亲水型填料有硅藻土、硅胶、棉纤的亲水型填料有硅藻土、硅胶、棉纤维等，其原理为分配作用。填料为支持物，水基维等，其原理为分配作用。填料为支持物，水基质中极性强的成分与填料结合牢固，流动相为与质中极性强的成分与填料结合牢固，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较亲脂的药物易分布于水不相混溶的有机溶剂，较亲脂的药物易分布于流动相，从而达到萃取的目的。流动相，从而达到萃取的目的。亲水型填料亲水型填料SPE有较高的萃取回收率（大于有较高的萃取回收率（大于80%），但洗脱剂用量较大（一般大于），但洗脱剂用量较大（一般大于5ml），），无浓集作用，萃取液较干净。无浓集作用，萃取液较干净。42SPE优点：优点：1、不发生乳化；、不发生乳化；2、适应的极性范、适应的极性范围较广；围较广；3、提取效率高；、提取效率高；4、方便快速；、方便快速；5、溶剂用量少；、溶剂用量少；6、易于自动化；、易于自动化；7、室、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。稳定的药物。目前，商品化固相提取小柱目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的应用已比较普遍。）的应用已比较普遍。最大的缺点：最大的缺点：贵贵 20多元多元/支支43三种方法的优缺点比较三种方法的优缺点比较44第三节 体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的灵敏度专属性色谱法+HPLC GC免疫法+免疫交叉反应，重现性生物学方法+特异性较差，需与色谱法平行使用二、分析方法的设计依据方法的建立原始方法改进创新创立方法1做好文献总结2充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3明确测定目的、要求目的4结合实验室条件 设备条件 预处理方法药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物三、分析方法的建立四、体内样品分析方法与方法验证四、体内样品分析方法与方法验证 （一)、特异性 所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。(二)、标准曲线与线性范围6.412.8 19.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(g/ml)Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995u至少6个浓度点建立标准曲线u线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推u最低浓度点偏差在20%u其余浓度点的偏差在 15%。四、体内样品分析方法与方法验证四、体内样品分析方法与方法验证Company Logo四、分析方法的评价可行性和可靠性 1准确度 accuracy 测定结果与真实性的差异 用回收率表示 接近100%相对恒定绝对回收率绝对回收率绝对回收率=提取回收率提取回收率=萃取回收率萃取回收率测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率考虑3个浓度（高、中、低）分布在标准曲线成上、中、下一般要求绝对回收率在70%一般方法HPLC内标内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值10%相对回收率相对回收率相对回收率=方法学回收率方法学回收率药物系列浓度+血样标准曲线取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值15%，定量限20%2精密度precision标准差SD相对标准性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20%日间精密度日内精密度3灵敏度（sensitivity）检测的最小量（1）检测限（LOD）从背景中检测到的最小药物浓度：S/N3的绝对量 LOD=3N/S （N噪间 S被测物信号/单位重量）N=1mm 取2gml样品，20l进样 峰度30mm LOD=4ng（2）定量限(LOQ)在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通常以标准曲线最低点作为一定量限，也可S/N=10作为定量限，实际测定时，满足35个半衰期浓度，或Cmax1/101/20（3）最低检测浓度可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因素有关最低检测浓度=LOQ/进样体积体内浓度检测限=仪器浓度检测限稀释度 1ml0.1ml 体内检测限=仪0.1 1ml10ml 体内检测限=仪10（4）提高灵敏度的方法 提高仪器灵敏度 提高进样量 降低仪器噪音 富集待测组分6稳定性（stability）（1）长期贮存稳定性-20-70（2）短期室温稳定性 室温放置424h（3）冷冻解冻稳定性 冷冻解冻冷冻解冻（4）贮备液稳定性 贮备液在室温或冷冻条件下结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！60