信号通路研究技术应用方式复习课程.ppt

信号通路研究技术应用方信号通路研究技术应用方式式一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定三、三、DNADNA重组技术的应用重组技术的应用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用六、细胞信号分子的荧光标记六、细胞信号分子的荧光标记六、细胞信号分子的荧光标记六、细胞信号分子的荧光标记七、细胞信号分子的三维结构分析七、细胞信号分子的三维结构分析七、细胞信号分子的三维结构分析七、细胞信号分子的三维结构分析八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究九、报告基因技术九、报告基因技术十、蛋白质与核酸相互作用技术十、蛋白质与核酸相互作用技术十一、对细胞内信号分子的干预技术十一、对细胞内信号分子的干预技术十二、信号分子基因表达检测技术十二、信号分子基因表达检测技术蛋白激酶磷酸化的检测蛋白激酶磷酸化的检测n n裂解培养的细胞获得裂解上清裂解培养的细胞获得裂解上清n n以免疫共沉淀法获得蛋白激酶以免疫共沉淀法获得蛋白激酶n nSDS-PAGEn n再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体n n以以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定一、蛋白激酶磷酸化及其活性测定经典蛋白激酶活性分析实验流程经典蛋白激酶活性分析实验流程n n以免疫共沉淀法获得蛋白激酶以免疫共沉淀法获得蛋白激酶n n加入该激酶底物和加入该激酶底物和 32-ATP，激酶使底，激酶使底物磷酸化物磷酸化n n放射自显影，确定磷酸化条带放射自显影，确定磷酸化条带n n以免疫共沉淀法获得蛋白激酶以免疫共沉淀法获得蛋白激酶n n加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化n n再加入底物磷酸化特异性抗体再加入底物磷酸化特异性抗体n n以以Phospho Ab-HRP Western 化学发光化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进而推出蛋白激酶活性而推出蛋白激酶活性非放射性蛋白激酶活性分析实验流程非放射性蛋白激酶活性分析实验流程较传统激酶活性测定方法的优点较传统激酶活性测定方法的优点n n无需接触放射性物质无需接触放射性物质无需接触放射性物质无需接触放射性物质n n敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子n n特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析特异性分析特异性分析特异性分析n n信噪比高信噪比高信噪比高信噪比高n n低背景低背景低背景低背景n n系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测试酶活的试剂试酶活的试剂试酶活的试剂试酶活的试剂n n节约时间：由几天降到几分钟节约时间：由几天降到几分钟节约时间：由几天降到几分钟节约时间：由几天降到几分钟024681012140 5 10 20 30 60 90 120 Time(min)Relative kinase activityDynamic processes of p38 activation by LPS in RAW cellsEffect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cellsMKK7(D)GST-ATF2GST-ELK1MKK1(E)MKK6(E)ControlHSP27PRAKControlAniso.ArseniteTNF-80kDa-47kDa-39kDa-80kDa-47kDakDa97.4-68.0-43.9-29.0-18.4-14.3-ControlAniso.ArseniteTNFABThe major kinases of p38 and p38P38 MAP Kinase PathwayP38 MAP Kinase PathwayPhosphopeptide map of HSP27 hosphorylated Phosphopeptide map of HSP27 hosphorylated by PRAK by PRAK in vitroin vitro ChromatographyElectrophoresis pH1.9+MAPKAPK2ChromatographyElectrophoresis pH1.9+PRAKChromatographyElectrophoresis pH1.9MIX+二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定二、蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定+-+-HSP27p38 GST-PRAK(93A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(212A 214A)GST-PRAK(182A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(182D 212D)+-+-+-Fold of Activation05101520GST-PRAK(182A)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(93A)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(182D 212D)GST-PRAK(212A 214A)BAElectrophoresis pH 8.9+p38-PRAK(182A)+p38-PRAK(182D)p38-PRAK(wt)T182 is the regulatory phosphorylation site of PRAKPCR primerPCR primer三、三、DNA重组技术的应用重组技术的应用v活性诱变体v无活性诱变体v结构与功能的研究JNK2JNK3JNK1p38p38 p38 p38 ERK1ERK2ERK5The relationship between the members of MAPK familyMAPK Dural Phosphorylation Sites L-12 Length *hp38 DFGLARHTDD-EMTGYVATRWYRAPE25hP38 DFGLARQADE-EMTGYVATRWYRAPE25hp38 DFGLARQADS-EMTGYVVTRWYRAPE25hp38 DFGLARHADA-EMTGYVVTRWYRAPE25hJNK1 DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK2 DFGLARTACTN-FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK3 DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE27hERK1 DFGLARIADPEHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE31hERK2 DFGLARVADPDHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE31hBMK1 DFGMARGLCTSPAEH-QYFMTEYVATRWYRAPE32YHOG1 DFGLARIQDP-QMTGYVSTRWYRAPE 25YSMK1 DFGLARGIHAGFFKCHS-TVQPHITNYVATRWYRAPE36YMPK1 DFGLARGYSENPVEN-SQFLTEYVATRWYRAPE32YKSS1 DFGLARCLASSSDSRET-LVGFMTEYVATRWYRAPE35YFUS3 DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE38domain VII VIIILoop-12(T-Loop)sequence of MAP kinasesConstruction of p38 loop-12 to ERK like structure p38 .DFGLARHTDDE-MTGYVATRWYRAPE.p38(E).DFGLARHTDDE-MTEYVATRWYRAPE.p38(6+).DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE.p38(6+E).DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE.p38(VAP).DFGLARVADPE-MTGYVATRWYRAPE.p38(DL).DFGLARHTDDD-LTGYVATRWYRAPE.p38(VAPD6+LE).DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.ERK2 .DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.MAPKMKKSubstratesLoop-12 is a key structure to determine the selection of substrate (.TXY.)-四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用四、病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用v腺病毒腺病毒v逆转录病毒逆转录病毒几种几种MAPKMAPK通路抑制剂的化学结构示意图通路抑制剂的化学结构示意图:ONH2OCH3OPD98059HNNSOFCH3NOHNFNHNSB202190SB203580CH=CHCH=CHOHOCH3OHOCH3OOCurcumin五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用五、细胞信号分子特异性抑制剂的应用Effects of SB203580 and PD98059 on endogenous PRAK activityHSP27TNF+-Arsenite+-PMA+-SB203580_ _-+-+-+PD98059-+-+-+-LPSEGFControl六、细胞信号分子的荧光标记六、细胞信号分子的荧光标记六、细胞信号分子的荧光标记六、细胞信号分子的荧光标记p38p38 p38 p38 p38p38 p38 p38 LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描LPS Control UV 蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用七、细胞信号分子的三维结构分析七、细胞信号分子的三维结构分析七、细胞信号分子的三维结构分析七、细胞信号分子的三维结构分析PHTHSH3SH2KinaseBtkSH3SH2KinaseSrc蛋白激酶结构域八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究八、蛋白质与蛋白质相互作用的研究1.蛋白质结合实验2.免疫共沉淀实验3.FRET 和 BRET荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer)生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer)4.酵母双杂合系统Identification of MEF2C as a substrate for p38第 一 步 附着第二步激活第三步紧密粘附第四步渗出ECEC：趋化因子受体：PECAM：白细胞整合素：选择素：选择素配体：白细胞激活物：Ig家族成员白细胞的渗出过程白细胞的渗出过程 5.噬菌体展示技术九、报告基因技术九、报告基因技术研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启动子转录活性的影响。051015Relative luciferase activityControlLPSEGFLPS+FHPIp38 is involved in the enhancement of TNF-promoter transactivityInduction of c-Jun through MEF2C phosphorylation by p38EMSA十、蛋白质与核酸相互作用技术十、蛋白质与核酸相互作用技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。反义核酸技术的应用十一、对细胞内信号分子的干预技术十一、对细胞内信号分子的干预技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。RNAiRNAiFigure 1.Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA.Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos.(A)Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe.(B)Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA(purple staining).(C)Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA.These embryos(and the parent animals)retain mex-3 mRNA,although levels may be somewhat less than wild type.(D)Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3;no mex-3 RNA is detected.(Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)十二、信号分子基因表达检测技术十二、信号分子基因表达检测技术 研究细胞内mRNA表达水平。HeartBrainPlacentaLungLiverSkeletal MuscleKidneyPancreasp38p38 p38 p38 kb3.5-2.5-1.8-2.0-Tissue distribution of mRNA of p38 isoformsp38、ATF2MEF2CCHOP10SAP1TNF-mRNA etc.monocytemacrophage Rt LPSMKK3/6MKKKsnucleusTK CD14PRAKsHSPCytoskeleton?LBP？THANKSFOR YOUR ATTENTION结束结束