2.2 分解尿素的细菌.ppt

课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数09生物组：庄生物组：庄晓晓冬冬1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O 实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包包括营养、温度、括营养、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止抑制或阻止其他其他微生物微生物生长。生长。选择性培养基选择性培养基15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.间接计数法（间接计数法（活活菌计菌计数法）数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细一个单细胞。胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加为使结果接近真实值可将同一稀释度加到到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂布，培的平皿中，经涂布，培养计算出菌落养计算出菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目实际数目低低。设设置对照的主要目的是排除实验组中置对照的主要目的是排除实验组中非非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁火焰旁进行进行 三三三三 样品的稀释样品的稀释样品的稀释样品的稀释.取样涂布取样涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标记培养皿作好标记。注明培。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。等。.取样涂布取样涂布分离不同的微生物采用不同的稀分离不同的微生物采用不同的稀释度释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在在菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落统计一次菌落数数目。目。选选取菌落数目稳定时的记录作为结取菌落数目稳定时的记录作为结果，果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。落的数目。培培养不同微生物往往需要不同培养温养不同微生物往往需要不同培养温度。度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微微生生物物的的培培养养与观察与观察 课课外延伸外延伸 在在以尿素为唯一氮源的培养基中加入以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。测测测测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述，通过记述，通过记述，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。得出水样中大肠杆菌的数量。得出水样中大肠杆菌的数量。得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: