最新应用微生物学PPT课件.ppt

应用微生物学应用微生物学应用微生物学应用微生物学n概论概论n微生物的生长微生物的生长n微生物的代谢微生物的代谢n微生物的遗传与遗传育种微生物的遗传与遗传育种n微生物基因工程微生物基因工程n应用微生物的基因操作系统应用微生物的基因操作系统n酶工程与生物转化酶工程与生物转化n微生物发酵微生物发酵n微生物代谢工程微生物代谢工程应用微生物学研究的一般流程提出问题（工业、农业、环境、健康、国防提出问题（工业、农业、环境、健康、国防）微生物？微生物？No Yes菌种菌种 解决问题解决问题发酵发酵 解决问题解决问题应用应用 解决问题解决问题应用微生物学的发展应用微生物学的发展 微生物学的发展是与应用紧密联系的n逐步建立方法认识微生物逐步建立方法认识微生物 Leenwenhock(1673)显微镜Jenner(1798)牛痘Basteur(1860s)发酵、低温灭菌、自然发生Koch(1881)纯培养n微生物形成产业微生物形成产业 Fleming(1929)青霉素 Waksman(1944)链霉素n现代生物技术现代生物技术Cohen(1972)DNA重组微生物细胞的结构n细胞壁细胞壁形态保持、物质交换、信号识别形态保持、物质交换、信号识别n细胞膜细胞膜转运转运n细胞质细胞质酶、反应场所酶、反应场所n细胞核细胞核遗传物质遗传物质n核外遗传物质核外遗传物质线粒体、质粒线粒体、质粒重要的应用微生物重要的应用微生物n病毒：病毒：-噬菌体噬菌体n细菌：大肠杆菌细菌：大肠杆菌(E.coli)棒杆菌棒杆菌(Corynebacterium)n放线菌：链霉菌放线菌：链霉菌(Streptomyces)n酵母菌：酿酒酵母酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)n真菌：曲霉真菌：曲霉(Aspergillus)第一章 微生物的生长n微生物生长的条件微生物生长的条件n培养基培养基n生长动力学生长动力学微生物细胞的化学组成细胞中几种主要元素的含量(干重的百分数)细胞干物质中主要组分和含量(%)元素细菌酵母菌霉菌C505345504063N1215 7.512.4710O203040H877细菌酵母菌霉菌蛋白质508032752040碳水化合物12282763710脂类520215440核酸1020681灰分物质210710510微生物生长的条件物质条件n水水aw=P/P0微生物类群最低aw值细菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80耐干霉菌0.65耐高渗酵母菌0.60微生物生长的条件物质条件n碳源和氮源碳源和氮源nOHPSKCaMgFenMnCuZnMoCoNiVBClNaSin维生素、氨基酸等维生素、氨基酸等 微生物生长的条件环境条件npH 中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱n温度温度 最适、生长、耐受最适、生长、耐受n氧气氧气 严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧n压力压力n渗透压渗透压n极端环境微生物极端环境微生物(extremophile)n不可培养微生物不可培养微生物(VBNC vive but non-cultured)极端微生物与不可培养微生物极端微生物与不可培养微生物n极端环境微生物极端环境微生物(extremophile):依赖于一种或多种依赖于一种或多种极端物化因子生存的微生物极端物化因子生存的微生物n嗜热菌：嗜热菌：50-80C (hyperthermophiles80C)n嗜冷菌：嗜冷菌：16Cn嗜酸菌：嗜酸菌：9n嗜盐菌：嗜盐菌：3Mn嗜压菌嗜压菌n不可培养微生物不可培养微生物(VBNC vive but non-cultured)培养基提供微生物生长所需物质与环境条件的提供微生物生长所需物质与环境条件的体系体系培养基的组成要素n碳源、氮源、提供各种元素的无机盐碳源、氮源、提供各种元素的无机盐n生长因子或含生长因子的物质生长因子或含生长因子的物质n水、固化基（固体培养基）水、固化基（固体培养基）npH、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件培养基的种类n按物理状态：固体、液体、半固体按物理状态：固体、液体、半固体n按化学组成：合成、丰富、半合成按化学组成：合成、丰富、半合成n按使用目的：种子、发酵、筛选、再按使用目的：种子、发酵、筛选、再 生、生、富集富集培养基的选择和设计原则培养基的选择和设计原则n适用：利于达到目的适用：利于达到目的 利于下游工艺利于下游工艺 重复性好重复性好n经济：原料价格经济：原料价格 原料用量原料用量 全工艺综合平衡全工艺综合平衡n安全：环境影响安全：环境影响 生物安全生物安全n培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容生长动力学n增值曲线增值曲线（Multiplicationcurve）：）：细胞数细胞数-时间时间n生长曲线生长曲线（growthcurve）：）：细胞量细胞量-时间时间微生物生长的实验计量n显微计数显微计数n菌落计数菌落计数n浊度测定浊度测定n细胞干重细胞干重微生物生长的数学描述 比生长速度比生长速度(specific growth rate)=dx/xdt细菌0.6-1.2酵母菌0.3-0.5放线菌0.1-0.3真菌0.1-0.3 生物量倍增时间生物量倍增时间(biomass doubling time)td=ln2/增值度增值度(multiplication degree)x/xo第二章 微生物的代谢n微生物初级代谢微生物初级代谢n微生物次级代谢微生物次级代谢n代谢调节代谢调节微生物的代谢 微生物细胞所进行的生化反应的总和微生物细胞所进行的生化反应的总和n物质代谢物质代谢 细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程n能量代谢能量代谢 载体载体n信息代谢信息代谢微生物初级代谢微生物初级代谢n微生物从环境摄取物质、获得能量、合成自身新物质微生物从环境摄取物质、获得能量、合成自身新物质的过程的过程 营养物废弃物能量（用于生长）能量合成代谢合成代谢（用于运动和物质转运）细胞组分酶分解代谢分解代谢能量来源重要的初级代谢途径n糖酵解途径糖酵解途径 糖代谢的共同分解途径糖代谢的共同分解途径n三羧酸循环三羧酸循环 将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量n磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径 产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物nEDED途径途径 细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径n氨基酸合成途径氨基酸合成途径糖酵解途径糖酵解途径(Embden-Meyerhof pathway)GLC HXK ZWF SOL GNDG6PG15LP6GRU5P PGIF6PPFKFBP F16PFBAGLYG3PDHAPGAP TPI TDHP13GPGK3PG GPM2PGENOPEPPYK PDC ADHPYRACAETH三羧酸循环三羧酸循环(Krebs cycle)PYRACoAMDH CITMALOAACTTFUM ACOFUMICISDH OSM IDPSUCSUCCAKG LSC KGD磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径氧化（氧化（产生产生NADPH）RU5P P6G G15L G6P RKI RPE非氧化非氧化 R5P X5P （分子重排分子重排）TKL TKLGAPS7PE4P TKLF6PED途径n存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中，是微生物特有的,将2-酮-3脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。氨基酸合成途径氨基酸合成途径GLC3PGSer,Gly,Met（3磷酸甘油酸衍生型）磷酸甘油酸衍生型）PPPR5PPEPPhe,Try,Trp （芳香族芳香族氨基酸）氨基酸）HisPRYAla,Val,Leu（丙酮酸衍生型）丙酮酸衍生型）OAAAspASA Lys（草酰乙酸衍生型）草酰乙酸衍生型）TCAAsnHSThrAKGMet Ile ArgGluGln（酮戊二酸衍生型）酮戊二酸衍生型）Pro微生物次级代谢微生物次级代谢次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有明确功能的物质的过程。明确功能的物质的过程。次级代谢（前体聚合、次级代谢（前体聚合、初级代谢初级代谢 结构修饰、装配）结构修饰、装配）营养物营养物 前体前体 次级代谢物次级代谢物 （初级代谢物）（初级代谢物）次级代谢的生物学意义次级代谢的生物学意义次次级级代代谢谢的的生生理理意意义义目目前前尚尚无无定定论论，但但它它肯肯定定对对微微生生物物是是有有意意义义的的，否否则则这这种种需需要要多多种种酶酶类类协协同同参参与与、并并在在精精细细的的调调节节机机制制控控制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。n维持初级代谢的平衡维持初级代谢的平衡n次级代谢产物作为储藏物质的一种形式次级代谢产物作为储藏物质的一种形式n使菌体在生存竞争中占优势使菌体在生存竞争中占优势n与细胞分化有关与细胞分化有关青霉素SCH3R-CO-NH-HCCHCBA CH3OC-N-CHCOOH侧链：R-CO-母核：噻唑环A，-内酰胺环B青霉素的生物合成代谢调节代谢调节 细胞为维持正常的生理功能，细胞为维持正常的生理功能，它的组分、代谢物、能量和电子载体它的组分、代谢物、能量和电子载体的合成大体上应保持恒定。当环境或的合成大体上应保持恒定。当环境或细胞自身发生某种变化时，可以通过细胞自身发生某种变化时，可以通过一定的反馈作用来达到平衡生长，这一定的反馈作用来达到平衡生长，这种反馈作用即代谢调节。种反馈作用即代谢调节。代谢调节的位点DNARNA酶底物底物产物（营养物）（或中间物）底物进入，酶的活性，酶的合成代谢调节的本质：酶的调节n酶合成的调节：诱导与阻遏酶合成的调节：诱导与阻遏基因水平基因水平n酶活性的调节：反馈抑制酶活性的调节：反馈抑制蛋白质水平蛋白质水平适应现象例例1，大肠杆菌乳糖代谢：大肠杆菌乳糖代谢：半乳糖苷酶乳糖-半乳糖+葡萄糖E.coli生长于无乳糖培养基，半乳糖苷酶：3 分子/细胞E.coli生长于含乳糖培养基，半乳糖苷酶：3000-5000 分子/细胞例例2，大肠杆菌色氨酸代谢：大肠杆菌色氨酸代谢：E.coli生长于无色氨酸培养基，合成色氨酸合成酶，当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应现象。现象。乳糖：诱导物诱导物(inducer)色氨酸：辅抑物辅抑物(corepressor)底物与诱导物n底物不等于诱导物底物不等于诱导物对 半乳糖苷酶乳糖IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）苯基半乳糖苷苯基硫代半乳糖苷作底物+-+-作诱导物+-乳糖操纵子iPOZYA调节基因i：编码阻遏蛋白启动子P：有CAP(CAP与cAMP复合物)和RNase两个位点操纵基因O：阻遏蛋白结合位点结构基因LacZ：半乳糖苷酶 LacY：半乳糖苷透性酶LacA：半乳糖苷转乙酰酶 协同诱导和顺序诱导协同诱导协同诱导Ia、b、cabc顺序诱导顺序诱导ABCDIaBbCc操纵子(operon)IPOS1S2S3调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 变构变构 (+or-)外界信号外界信号调节蛋白调节蛋白IorCoR 操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的调控。调控。诱导与阻遏调节调节 调节蛋白活性调节蛋白活性 操纵子操纵子 结构基因结构基因 酶合成酶合成诱导诱导 正正 打开打开 表达表达 诱导诱导 负负 打开打开 表达表达 阻遏阻遏 正正 关闭关闭 不表达不表达 阻遏阻遏 负负 关闭关闭 不表达不表达 反馈抑制n反馈抑制：反馈抑制：在合成代谢途径中，代谢终产物抑制途径中第一个酶的作用。E1E2E3E4ABCDEn反馈抑制能对环境变化做出快速反应反馈抑制能对环境变化做出快速反应n特点：特点：1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制2，受抑制的是途径中的第一个酶3，反馈抑制是可逆的别构酶别构酶(allosteric enzyme)n有多亚基和四级结构有多亚基和四级结构n有结合底物的活性中有结合底物的活性中心和结合调节物的别心和结合调节物的别构中心构中心n活性中心和别构中心活性中心和别构中心在酶分子的不同部位在酶分子的不同部位分支生物合成途径的调节 P1 A B C P2n协同反馈抑制协同反馈抑制n同功酶反馈抑制同功酶反馈抑制n累积反馈抑制累积反馈抑制n顺序反馈抑制（细调）顺序反馈抑制（细调）协同反馈抑制协同反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。同功酶反馈抑制同功酶反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。积累反馈抑制积累反馈抑制 P1 A B C P2 每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一起达到最大程度的反馈抑制。一起达到最大程度的反馈抑制。顺序反馈抑制顺序反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。第三章 微生物的遗传与菌种选育n微生物的遗传物质微生物的遗传物质n基因突变基因突变n基因重组基因重组n遗传育种遗传育种微生物的遗传物质核酸核酸(DNARNA)n染色体染色体n染色体外遗传物质染色体外遗传物质DNA是遗传物质的实验证明n肺炎双球菌转化肺炎双球菌转化 S-dead，S-alive，R-alive S dead-S-S Rn噬菌体感染噬菌体感染 T2(DNA-32P,protein-35S)-E.coli-上清上清T2（35S）沉淀沉淀E.coli（32P ）n双螺旋模型双螺旋模型遗传育种n基本过程基本过程 基因突变、重组、导入、敲除筛选出发菌株 包含变异株的群体 优良变异株 目的株 检验检验n产生变异株产生变异株n选择变异株选择变异株n检验变异株检验变异株基因突变n遗传物质小范围的改变，只涉及一对或少数几遗传物质小范围的改变，只涉及一对或少数几对碱基，又称点突变。对碱基，又称点突变。基因突变的类型n基因型基因型 置换：置换：GA,CT 转换转换(transition)；G,A C,T颠换颠换(transversion)移码移码(frameshift)：DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失n表型表型 形态：造成形态发生改变的突变形态：造成形态发生改变的突变 致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变 条件致死：在一定条件下有致死效应的突变条件致死：在一定条件下有致死效应的突变 生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等n翻译翻译 同义、错义、无义同义、错义、无义(UAG,UGA,UAA)基因突变的特性n稀有性稀有性 突变率低（可通过理化处理提高突变率）突变率低（可通过理化处理提高突变率）n随机性随机性n独立性独立性 Kmr 10-5,Apr 10-6,Kmr Apr 10-11n可逆性可逆性 回复突变率也很低回复突变率也很低n稳定性稳定性n突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。几种微生物每次复制的突变率微生物微生物基因组大小基因组大小（bp）突变率突变率（碱基）（碱基）突变率突变率（基因组）（基因组）噬菌体M136.41037.21070.0046噬菌体4.91047.71080.0038噬菌体T2、T41.71052.41080.0040大肠杆菌4.61065.410100.0025酿酒酵母1.21072.210100.0027粗糙脉胞菌4.21077.210110.0030平均0.0034诱变剂 能引起微生物遗传物质发生改变的能引起微生物遗传物质发生改变的化学物理因子化学物理因子化学：碱基类似物（化学：碱基类似物（5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外线）物理：短波（紫外线）射线（射线（X-射线、射线、射线）射线）诱变剂的作用诱变剂诱变剂诱变作用诱变作用对对DNA的影响的影响诱变能力诱变能力5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶碱基错配碱基错配转换转换(AT GC)弱弱羟胺羟胺胞嘧啶脱酰胺胞嘧啶脱酰胺转换转换(GCAT)弱弱亚硝酸亚硝酸A、C、G脱酰胺脱酰胺转换转换(AT GC)、缺失、缺失中中亚硝基胍亚硝基胍A、C烷基化烷基化转换转换(GCAT)强强硫酸二乙酯硫酸二乙酯A、C烷基化烷基化转换转换(GCAT)强强溴化乙啶溴化乙啶嵌入碱基对嵌入碱基对移码移码弱弱紫外线紫外线嘧啶二聚嘧啶二聚转换转换(GCAT)、巅换、巅换、缺失、移码缺失、移码中中射线射线DNA单链或双链断裂单链或双链断裂结构改变、缺失结构改变、缺失强强基因突变的应用-诱变育种n虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是重要而基本的育种方法。重要而基本的育种方法。n诱变育种的基本步骤：诱变育种的基本步骤：出发株出发株诱变剂处理诱变剂处理初筛初筛复筛复筛鉴定鉴定 一般要进行多次，以积累有益突变。一般要进行多次，以积累有益突变。n诱变谱系：诱变谱系：诱变剂处理诱变剂处理1 诱变剂处理诱变剂处理2出发株出发株 中间株中间株1 中间株中间株2 目的株目的株 诱变育种的关键环节n出发株：性状、潜力出发株：性状、潜力n诱变处理：诱变剂选择、剂量诱变处理：诱变剂选择、剂量n筛选：方法、筛选量筛选：方法、筛选量nHigh-throughput screening致死率与诱变效果突变株的筛选n初筛：弃去大量无价值菌株初筛：弃去大量无价值菌株n复筛：选出少数有价值菌株复筛：选出少数有价值菌株n方法：方法：n 直接测定直接测定n 利用可观察现象利用可观察现象n 营养限制培养基营养限制培养基n 选择培养基选择培养基组成型育种 半乳糖苷酶半乳糖苷酶n加诱导酶抑制剂加诱导酶抑制剂 培养基：培养基：乳糖乳糖+邻硝基邻硝基-D-岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂）岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂）只有组成型能利用乳糖只有组成型能利用乳糖n交替培养法交替培养法 培养基培养基1：乳糖：乳糖 培养基培养基2：葡萄糖：葡萄糖 交替培养使组成型优势扩大交替培养使组成型优势扩大交替培养法交替培养法组成型组成型诱导型诱导型组成型：诱导型组成型：诱导型1061061:1乳糖乳糖106-108106 2x10650:1葡萄糖葡萄糖107-1092x105-2x10750:1乳糖乳糖108-10102x106-4x1062500:1葡萄糖葡萄糖109-10114x105-4x1072500:1乳糖乳糖1010-10124x106-8x106125000:1葡萄糖葡萄糖1011-10138x105-8x107125000:1营养缺陷型育种营养缺陷型营养缺陷型 C-A B C B 积累积累 A B C D 积累积累 D抗反馈抑制育种n原理：原理：产物产物+酶（结合于调节中心）酶（结合于调节中心）反馈抑制反馈抑制 类似物类似物+酶（结合于调节中心）酶（结合于调节中心）影响生长影响生长 抗类似物的变异株抗类似物的变异株 类似物与酶的调节中心不能结合类似物与酶的调节中心不能结合 产物与酶的调节中心不能结合产物与酶的调节中心不能结合 反馈抑制解除反馈抑制解除 产物能过量积累产物能过量积累抗反馈抑制育种举例n苏氨酸苏氨酸 C.crenatum AS 1.542 0 mg/ml MNNG LR-1458 AHVr 6mg/ml A)：使G的7位和A的3位N部分甲基化，中性pH加热，G(少量A)碱基脱落，再用0.1molNaOH处理，加热到90C使糖基脱落n硫酸二甲酯处理后加稀酸:A先断裂(AG)，再用0.1molNaOH处理，加热到90C使糖基脱落nDNA与肼反应(C+T)：C、T脱落成核糖脲，与哌啶作用在C、T处切断DNAnDNA与肼反应时加2MNaCl(C)：可抑制T脱落双脱氧法双脱氧法n4种反应体系中掺入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP，反应分别止于A、C、G、Tn控制dNTP与ddNTP的比例，可得不同长度的DNA片段M13噬菌体序列分析系统nM13噬菌体：丝状噬菌体，基因组为环状单链DNA，在细胞内的复制型(RF)为环状双链DNA MCS LacZ M13mp18 (7.25kb)质粒的稳定性n质粒稳定性的检测方法：质粒稳定性的检测方法：100%一定代期或时间一定代期或时间选择性培养基选择性培养基 非非选择性培养基选择性培养基 非非选择性培养基选择性培养基(M)选择性培养基选择性培养基(m)质粒丢失率质粒丢失率=(M-m)/M100%质粒不稳定性的分类n分离不稳定性分离不稳定性(segregational instability)：质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失n结构不稳定性结构不稳定性(structural instability)：重组质粒外源重组质粒外源DNA的丢失或发生缺失、插的丢失或发生缺失、插入、重排等入、重排等分离不稳定的影响因素与改善途径影响因素影响因素n载体类型载体类型n克隆克隆DNA的来源的来源n质粒大小质粒大小n质粒拷贝数质粒拷贝数n分配功能分配功能n温度温度改善途径改善途径n选择恰当质粒选择恰当质粒n确定适宜的克隆基因来源确定适宜的克隆基因来源n限制插入片断大小限制插入片断大小n用高拷贝数质粒用高拷贝数质粒n引入稳定功能或编码必需产引入稳定功能或编码必需产物的基因物的基因结构不稳定的影响因素与改善途径影响因素影响因素n强启动子的存在，产物过量强启动子的存在，产物过量可能影响质粒的复制等功能可能影响质粒的复制等功能nDNA复制时经过单链为中介，复制时经过单链为中介，引起分子内重排引起分子内重排nDNA重复序列在复制时引起重复序列在复制时引起缺失缺失改善途径改善途径n用低拷贝数质粒或染色体插用低拷贝数质粒或染色体插入载体入载体n用热诱导启动子，时间控制用热诱导启动子，时间控制基因表达基因表达n引入使单链引入使单链DNA高效转化为高效转化为双链双链DNA的序列的序列n除去引起缺失作用的序列除去引起缺失作用的序列期中思考题n请各列举1个可应用微生物来解决的实际问题和不可应用微生物来解决的实际问题，并简单说明理由。