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微生物遗传与育种实验微生物遗传与育种实验实验目的实验目的n n掌握微生物遗传与育种的相关研究技术：掌握微生物遗传与育种的相关研究技术：诱变、杂交、转化、性状检测、遗传分诱变、杂交、转化、性状检测、遗传分析等析等n n将遗传学知识与育种技术相结合，达到将遗传学知识与育种技术相结合，达到具备独立进行遗传学实验设计、微生物具备独立进行遗传学实验设计、微生物育种技术路线设计与现代微生物分子遗育种技术路线设计与现代微生物分子遗传技术操作能力的目标。传技术操作能力的目标。二、根瘤菌抗生素抗性检测二、根瘤菌抗生素抗性检测实验步骤：1.1.配制含抗生素配制含抗生素TYTY培养基（氯霉素培养基（氯霉素5 5g/ml，利福霉素，利福霉素5g/ml）；2.2.接种：斜面接种：斜面平板；平板；3.3.培养培养36 h36 h后观察生长情况，确定根瘤菌后观察生长情况，确定根瘤菌抗药性。抗药性。结果：菌落生长，说明？结果：菌落生长，说明？三、用梯度平板法筛选根瘤菌抗药三、用梯度平板法筛选根瘤菌抗药性突变株性突变株 1 1、制备菌液、制备菌液、制备菌液、制备菌液2 2、紫外线诱变、紫外线诱变、紫外线诱变、紫外线诱变3 3、增殖培养（黑暗下操作）、增殖培养（黑暗下操作）、增殖培养（黑暗下操作）、增殖培养（黑暗下操作）4 4、制备梯度培养皿、制备梯度培养皿、制备梯度培养皿、制备梯度培养皿5 5、涂布菌液、涂布菌液、涂布菌液、涂布菌液6 6、抗药性的测定、抗药性的测定、抗药性的测定、抗药性的测定三、两亲本杂交三、两亲本杂交实验步骤：实验步骤：实验步骤：实验步骤：1.1.1.1.菌体培养（实验准备）：菌体培养（实验准备）：菌体培养（实验准备）：菌体培养（实验准备）：n n根瘤菌：根瘤菌：根瘤菌：根瘤菌：TYTYTYTY培养基培养基培养基培养基5 ml5 ml5 ml5 ml试管，接种，培养试管，接种，培养试管，接种，培养试管，接种，培养20 20 20 20 h h h hn n大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（pSC123pSC123pSC123pSC123）：）：）：）：LBLBLBLB培养基培养基培养基培养基5 ml5 ml5 ml5 ml试管，接种，培养试管，接种，培养试管，接种，培养试管，接种，培养18h18h18h18h2.2.2.2.离心：离心：离心：离心：8000 rpm8000 rpm8000 rpm8000 rpm离心离心离心离心2 2 2 2 min min min min，收集菌体沉淀，用无菌水，收集菌体沉淀，用无菌水，收集菌体沉淀，用无菌水，收集菌体沉淀，用无菌水重悬，再次重悬，再次重悬，再次重悬，再次8000 rpm8000 rpm8000 rpm8000 rpm离心离心离心离心2 2 2 2 min min min min，收集菌体沉淀，用，收集菌体沉淀，用，收集菌体沉淀，用，收集菌体沉淀，用TYTYTYTY培养基培养基培养基培养基1000100010001000 llll重悬。重悬。重悬。重悬。3.3.3.3.杂交：分别取杂交：分别取杂交：分别取杂交：分别取200 200 200 200 llll根瘤菌和根瘤菌和根瘤菌和根瘤菌和E.coliE.coliE.coliE.coli菌悬液混合，加菌悬液混合，加菌悬液混合，加菌悬液混合，加1000 l TY1000 l TY1000 l TY1000 l TY培养基，静置培养基，静置培养基，静置培养基，静置24 h24 h24 h24 h后涂布选择性平板筛选后涂布选择性平板筛选后涂布选择性平板筛选后涂布选择性平板筛选杂交子。杂交子。杂交子。杂交子。4.4.4.4.选择性平板：无氮培养基（选择性平板：无氮培养基（选择性平板：无氮培养基（选择性平板：无氮培养基（KnKnKnKn 50505050 gggg/ml/ml/ml/ml，Rif Rif Rif Rif 50505050 g/mlg/mlg/mlg/ml）5.5.5.5.挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。四、电转化四、电转化实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤n n准备工作：准备工作：准备工作：准备工作：制备选择性平板制备选择性平板制备选择性平板制备选择性平板TYTY培养基（培养基（培养基（培养基（Kn 100 g/mlKn 100 g/ml，Rif 100 Rif 100 g/mlg/ml）。）。）。）。提取要转化的质粒提取要转化的质粒提取要转化的质粒提取要转化的质粒DNADNA，miniTn5miniTn5。制备根瘤菌菌悬制备根瘤菌菌悬制备根瘤菌菌悬制备根瘤菌菌悬液。液。液。液。n n转化：在电转化用的石英样品杯、质粒转化：在电转化用的石英样品杯、质粒转化：在电转化用的石英样品杯、质粒转化：在电转化用的石英样品杯、质粒DNADNA、TYTY培养基、根瘤菌菌培养基、根瘤菌菌培养基、根瘤菌菌培养基、根瘤菌菌悬液悬液悬液悬液50 l50 l按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取200-1000 l200-1000 l、20-100 l20-100 l、0.5-10 l 0.5-10 l 移液器到超净工作台上。先用移液器到超净工作台上。先用移液器到超净工作台上。先用移液器到超净工作台上。先用0.5-0.5-10 l10 l移液器取移液器取移液器取移液器取2 l2 l质粒质粒质粒质粒DNADNA到根瘤菌细胞内，再用调节到到根瘤菌细胞内，再用调节到到根瘤菌细胞内，再用调节到到根瘤菌细胞内，再用调节到50 l 50 l 的的的的（20-100 l20-100 l移液器）上下吹吸数次。在冰上放置移液器）上下吹吸数次。在冰上放置移液器）上下吹吸数次。在冰上放置移液器）上下吹吸数次。在冰上放置2 min2 min。用调节到。用调节到。用调节到。用调节到50 50 l l 的（的（的（的（20-100 l20-100 l移液器）将质粒移液器）将质粒移液器）将质粒移液器）将质粒DNADNA和细胞混合液转移到电转化石和细胞混合液转移到电转化石和细胞混合液转移到电转化石和细胞混合液转移到电转化石英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置1-1-2 min2 min。先用纸将样品槽擦拭一下，移到。先用纸将样品槽擦拭一下，移到。先用纸将样品槽擦拭一下，移到。先用纸将样品槽擦拭一下，移到2 kV2 kV电脉冲发生器上，同时电脉冲发生器上，同时电脉冲发生器上，同时电脉冲发生器上，同时用用用用1000 l1000 l移液器吸好移液器吸好移液器吸好移液器吸好TYTY培养基培养基培养基培养基1 ml1 ml，约，约，约，约4.5-5 sec4.5-5 sec后鸣叫声停后，立即后鸣叫声停后，立即后鸣叫声停后，立即后鸣叫声停后，立即加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。n n培养：将细胞悬浮液从样品槽中取出并加入培养：将细胞悬浮液从样品槽中取出并加入培养：将细胞悬浮液从样品槽中取出并加入培养：将细胞悬浮液从样品槽中取出并加入1.5 ml 1.5 ml 离心管离心管离心管离心管中，在中，在中，在中，在2828，200/min200/min振荡培养振荡培养振荡培养振荡培养1 h1 h。在样品槽中加满自来。在样品槽中加满自来。在样品槽中加满自来。在样品槽中加满自来水，以便清洗。将培养后的转化菌悬液在超净工作台上全水，以便清洗。将培养后的转化菌悬液在超净工作台上全水，以便清洗。将培养后的转化菌悬液在超净工作台上全水，以便清洗。将培养后的转化菌悬液在超净工作台上全部倒入部倒入部倒入部倒入1.5 ml1.5 ml微量离心管，微量离心管，微量离心管，微量离心管，12000 rpm12000 rpm离心离心离心离心30 s30 s（或到达（或到达（或到达（或到达13000 rpm13000 rpm后离心后离心后离心后离心15 s15 s）。用）。用）。用）。用1000 l1000 l移液器取出大部分的上移液器取出大部分的上移液器取出大部分的上移液器取出大部分的上清，再用清，再用清，再用清，再用50 l50 l移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取100 100 l TYl TY培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。取重培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。取重培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。取重培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。取重新悬浮后的转化根瘤菌新悬浮后的转化根瘤菌新悬浮后的转化根瘤菌新悬浮后的转化根瘤菌30 l30 l加入选择性平板中心，涂布。加入选择性平板中心，涂布。加入选择性平板中心，涂布。加入选择性平板中心，涂布。将选择平板在将选择平板在将选择平板在将选择平板在2828下培养，下培养，下培养，下培养，1 1天后观察转化效果。天后观察转化效果。天后观察转化效果。天后观察转化效果。n n清洗电转化样品槽。先用自来水吸瓶冲洗十多次，之后加清洗电转化样品槽。先用自来水吸瓶冲洗十多次，之后加清洗电转化样品槽。先用自来水吸瓶冲洗十多次，之后加清洗电转化样品槽。先用自来水吸瓶冲洗十多次，之后加入酒精，放置入酒精，放置入酒精，放置入酒精，放置1 h1 h，之后用蒸馏水冲洗数次，甩干后，水平，之后用蒸馏水冲洗数次，甩干后，水平，之后用蒸馏水冲洗数次，甩干后，水平，之后用蒸馏水冲洗数次，甩干后，水平放置在滤纸上晾干。放置在滤纸上晾干。放置在滤纸上晾干。放置在滤纸上晾干。五、杂交子鉴定五、杂交子鉴定实验步骤：实验步骤：n n挑取在选择性平板上生长的菌落，划线纯挑取在选择性平板上生长的菌落，划线纯化，观察菌落特征和多糖产量。化，观察菌落特征和多糖产量。n n挑取纯化后的杂交子接种于蔗糖培养基，挑取纯化后的杂交子接种于蔗糖培养基，振荡培养振荡培养36 h36 h后观察并测定多糖产量。后观察并测定多糖产量。n n培养基培养基n nTYTY培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨5.0 g5.0 g，酵母粉酵母粉酵母粉酵母粉3.0 g3.0 g，CaCl2 0.3 gCaCl2 0.3 g，水，水，水，水1000 ml1000 ml，pH7.0pH7.0n n蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖10.0 g10.0 g，酵母膏，酵母膏，酵母膏，酵母膏4.0 g4.0 g，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾，磷酸氢二钾0.5 g0.5 g，硫酸镁硫酸镁硫酸镁硫酸镁0.2 g0.2 g，氯化钠，氯化钠，氯化钠，氯化钠0.2 g0.2 g，钼酸钠（，钼酸钠（，钼酸钠（，钼酸钠（0.5%0.5%溶液）溶液）溶液）溶液）4.0 ml4.0 ml，硼酸（，硼酸（，硼酸（，硼酸（0.5%0.5%溶液）溶液）溶液）溶液）4.0 ml4.0 ml，碳酸钙碳酸钙碳酸钙碳酸钙5.0 g5.0 g，水，水，水，水1000.0 ml1000.0 ml，pH7.2-7.4pH7.2-7.4n nLBLB培养基：培养基：培养基：培养基：n n仪器设备：仪器设备：n n摇床，天平，大容量离心机，超净工作台，摇床，天平，大容量离心机，超净工作台，摇床，天平，大容量离心机，超净工作台，摇床，天平，大容量离心机，超净工作台，灭菌锅，移液器，灭菌锅，移液器，灭菌锅，移液器，灭菌锅，移液器，500 ml500 ml三角瓶，离心三角瓶，离心三角瓶，离心三角瓶，离心杯，试管，高速离心机，电转化仪杯，试管，高速离心机，电转化仪杯，试管，高速离心机，电转化仪杯，试管，高速离心机，电转化仪