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Chapter 2 微生物发酵产酶微生物发酵产酶 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism Contents of chapter 22.4、酶的生物合成及调节2.1、产酶微生物产酶微生物2.2、酶的发酵工艺条件及控制酶的发酵工艺条件及控制2.3、酶生产过程的动力学动物、植物生产酶制剂的缺陷：动物、植物生产酶制剂的缺陷：n植物由于生长地域、季节、气候生长地域、季节、气候等的影响，生产酶制剂的产量、质量都不稳定。n动物产生的酶主要从屠宰牲畜的腺体腺体中提取，来源有限来源有限。微生物微生物的优势的优势种类繁多种类繁多 生长周期短生长周期短繁殖快繁殖快培养相对简单培养相对简单 较强的适应性较强的适应性和突变能力和突变能力产酶微生物产酶微生物来源来源土土 壤壤 空气空气极端极端 环境环境 水体水体 极端环境微生物嗜冷菌嗜冷菌嗜酸菌嗜酸菌嗜盐菌嗜盐菌产酶微生物产酶微生物种类种类细菌细菌bacteria酵母菌酵母菌yeast霉菌霉菌mold放线菌放线菌actinomycetes青霉素酰化酶青霉素酰化酶溶菌酶溶菌酶淀粉酶淀粉酶蛋白酶蛋白酶葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶抗生素抗生素啤酒酵母啤酒酵母食品酵母食品酵母淀粉酶淀粉酶果胶酶果胶酶 产酶微生物的基本要求产酶微生物的基本要求n不是致病菌，不产生毒素及有害物质；不是致病菌，不产生毒素及有害物质；n发酵周期短，生产成本低，产酶量高；发酵周期短，生产成本低，产酶量高；n遗传性稳定，不易变异退化，不感染噬菌体；遗传性稳定，不易变异退化，不感染噬菌体；n最好是产生胞外酶的菌种，利于分离纯化；最好是产生胞外酶的菌种，利于分离纯化；n对医药和食品用酶，还应考虑安全性；对医药和食品用酶，还应考虑安全性；n基因工程菌必须符合安全性要求。基因工程菌必须符合安全性要求。酶制剂安全检查指标酶制剂安全检查指标项目项目数量数量项目项目数量数量重金属重金属（mg/kgmg/kg）4040霉菌数（个霉菌数（个/g/g）100100铅（铅（mg/kgmg/kg）1010大肠杆菌群大肠杆菌群（个（个/g/g）3030砷（砷（mg/kgmg/kg）33大肠杆菌大肠杆菌（个（个/g/g）不准含有不准含有黄曲霉毒素黄曲霉毒素不准含有不准含有沙门氏菌沙门氏菌（个（个/g/g）不准含有不准含有细菌总数细菌总数（个（个/g/g）5000050000绿脓杆菌绿脓杆菌（个（个/g/g）不准含有不准含有(1)(1)大肠杆菌大肠杆菌n大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。会引起腹泻和尿路感染。n大肠杆菌的优势主要因它易于在实验室操作、生长迅大肠杆菌的优势主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。速，而且营养要求低。应用：应用：大肠杆菌也是大肠杆菌也是最早最早用作基因工程的宿主菌；用作基因工程的宿主菌；大多数是胞内酶，需进行细胞破碎；大多数是胞内酶，需进行细胞破碎；工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。DNADNA聚合酶、连接酶、限制性内切酶聚合酶、连接酶、限制性内切酶等。等。(2)(2)醋酸杆菌（醋酸杆菌（AcetobacterAcetobacter）n菌体从椭圆至杆状，单个、菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良和酵母膏的培养基上生长良好。好。n应用：有机酸有机酸(食醋等）葡萄食醋等）葡萄糖异构酶糖异构酶(高果糖浆高果糖浆 )山梨糖山梨糖 (维维C C中间体）。中间体）。(3)枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus Bacillus subtilissubtilis）n直状、近直状的杆菌，周生或直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚革兰氏阳性，无荚膜，芽孢膜，芽孢0.51.5 1.8 m。n枯草芽孢杆菌是工业发酵的重枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产要菌种之一。生产淀粉酶、蛋淀粉酶、蛋白酶、白酶、5-核苷酸酶、某些氨基核苷酸酶、某些氨基酸及核苷、酸及核苷、碱性磷酸酶碱性磷酸酶。(4)链霉菌链霉菌(actinomycetes)应用：应用：生产葡萄糖异构酶；生产葡萄糖异构酶；青霉素酰化酶、纤维素酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶等。几丁质酶等。(5)根霉根霉(Rhizopus)n分布于土壤、空气中，常见于分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。和水果、蔬菜的腐烂。代表种：米根霉（代表种：米根霉（R.oryzae)、黑根霉黑根霉(R.nigrican)等。等。n应用：应用：产生如淀粉酶、果胶酶、脂肪产生如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸化菌。有些根霉还能产生乳酸延胡索酸等有机酸。延胡索酸等有机酸。(6)曲霉曲霉(Aspergillus)n分类：多数属于子囊菌亚门，少数分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。属于半知菌亚门。n分布：广泛分布于土壤、空气和谷分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。曲霉毒素。n代表种：黑曲霉代表种：黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉、黄曲霉Asp.flavusn应用：应用：是制酱、酿酒、制醋的主要是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶淀粉菌种。是生产酶制剂（蛋白酶淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。酸等）。农业农业上用作生产糖化饲料的菌种。上用作生产糖化饲料的菌种。n应用：应用：啤酒、酒类生产；啤酒、酒类生产；生产转化酶、生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。醇脱氢酶等。(7)啤酒酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)蛋白酶：蛋白酶：59%糖化酶：糖化酶：13%淀粉酶：淀粉酶：5%葡萄糖异构酶：葡萄糖异构酶：6%果胶酶：果胶酶：3%纤维素酶：纤维素酶：1%脂肪酶：脂肪酶：3%医药与分析研究用酶：医药与分析研究用酶：10%不同类型工业酶的比例不同类型工业酶的比例调查研究及查阅资料调查研究及查阅资料 设计试验方案设计试验方案 确定采集采集样品的生态环境 平板分离平板分离 确定特殊的培养基及可能的定性或半定量快速检出法 原种斜面原种斜面 确定发酵培养基础条件 初筛初筛 复筛复筛 再复筛再复筛 菌株菌株 生产性试验 符合工业生产要求单株纯种分离单株纯种分离 毒性试验 符合安全性要求 生产生产 菌种鉴定 菌种保藏（1）含菌样品采集）含菌样品采集n相近菌种产生的酶性质相近；n胞外酶的稳定性和最适条件与菌的最适生长条件接近；n获得能降解某物质的产酶菌，可从该物质分布丰富的地方寻找。（2）菌的分离纯化）菌的分离纯化 平板划线 稀释分离（3）产酶性能测定）产酶性能测定初筛：选出含有目的酶的菌株，平板培养透明圈法；复筛：选出产酶量高、性能更符合要求的菌株。（4）菌种的退化与复壮）菌种的退化与复壮变异和退化保存和培养条件纯种分离（5）活化与扩大培养）活化与扩大培养菌种斜面活化逐级放大培养种子：培养基、条件、种龄、接种量、质量检测、异常情况 诱变育种诱变育种原生质体融合育种原生质体融合育种基因工程育种基因工程育种 基因洗牌法（基因洗牌法（gene shuffling）定向进化（定向进化（directed evolution）输入参数输入参数底物物理条件底物物理条件 结构部分结构部分 代谢转化代谢转化酶合成酶合成转录转录翻译翻译翻译后翻译后修饰修饰 输出参数输出参数 细胞组成物质细胞组成物质 副产品副产品调节机制调节机制代谢过程流程2.2.2 发酵罐及培养基2.2.3 发酵条件及控制2.2.4 提高产酶的措施2.2.1 发酵生产的优势发酵方法发酵方法 1、固体培养发酵固体培养发酵设备简单、污染少、霉菌设备简单、污染少、霉菌 2、液体深层发酵、液体深层发酵纯度高、易控制条件、纯度高、易控制条件、机械强度高、利用率高机械强度高、利用率高 3、分批发酵、分批发酵 4、连续发酵、连续发酵 5、补料分批发酵、补料分批发酵 微生物发酵生产法的优点微生物发酵生产法的优点n 酶的品种齐全 n 酶的产量高 n 生产成本低n 便于提高酶制品获得率保藏细胞保藏细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养发酵发酵分离纯化分离纯化酶酶固定化细胞固定化细胞原生质体原生质体固定化原生质体固定化原生质体培养基培养基预培养预培养无菌空气无菌空气微生物发酵产酶的工艺流程微生物发酵产酶的工艺流程发酵灌的类型：传统的、自吸式、气生式、内外循环等 培养基培养基各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。培养基（培养基（mediummedium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素1、选择适宜的营养物质、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜、物理、化学条件适宜4、经济节约、经济节约5、精心设计、试验比较、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则培养基的设计原则常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物；蛋白质及其降解物；水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）；）；水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）；水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）；水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动；水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动；调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）。调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）。水水碳源碳源大多数产酶微生物以大多数产酶微生物以淀粉或其水解物淀粉或其水解物为碳源；为碳源；异养异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）。微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）。碳源对酶合成的生物调节：阻遏、诱导。碳源对酶合成的生物调节：阻遏、诱导。构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、磷常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化镁、铁等元素的化合物。合物。氮源氮源无机盐无机盐需要注意合适的需要注意合适的碳氮比碳氮比生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分生物和类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子种生长因子 实验室的常用培养基实验室的常用培养基 细细 菌菌:牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉霉 菌：查氏合成培养基菌：查氏合成培养基.n枯草杆菌枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%,糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。n黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。n地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。n黑曲霉黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基酸性蛋白酶发酵培养基:玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH 5.5)。n游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05%(pH 7.2)。n桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。n黑曲霉黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基果胶酶发酵培养基:麸皮5%,果胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。n枯草杆菌枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基碱性磷酸酶发酵培养基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)2.2.3 2.2.3 发酵条件及控制发酵条件及控制不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物要求不同不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物要求不同pHpH的培养基。的培养基。通常培养条件：通常培养条件：细菌与放线菌：细菌与放线菌：pH6.5-8.0 pH6.5-8.0 酵母菌和霉菌：酵母菌和霉菌：pH4.5-6pH4.5-6（1 1）pHpH值对产酶的影响与调节控制值对产酶的影响与调节控制细胞发酵产酶的细胞发酵产酶的最适最适pHpH值与生长最适值与生长最适pHpH值值往往有所不同。细胞生产往往有所不同。细胞生产某种酶的最适某种酶的最适pHpH值通常接近于该酶催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适pHpH值。值。有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。维持培养基维持培养基pH的方法：的方法：通常在培养基中加入通常在培养基中加入pH缓冲剂；缓冲剂；在进行工业发酵时补加酸、碱；在进行工业发酵时补加酸、碱；最成功的是补料：最成功的是补料：稳定稳定pH、解除产物的阻遏作用、解除产物的阻遏作用、补充营养物质。补充营养物质。（NH4）2SO4/氨水氨水通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。（2 2）温度的影响与调控）温度的影响与调控有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。枯草杆菌的最适生长温度为3437黑曲霉的最适生长温度为2832 调节温度的方法：n热水升温n冷水降温n热交换装置：排管、蛇管、喷淋管等。n随时准备冷、热水。（3 3）溶解氧的控制）溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。临界氧浓度临界氧浓度 培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。调节通气量调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质 控制溶解氧方法（4）泡沫的影响）泡沫的影响阻碍二氧化碳排除、影响氧溶解、发酵液外溢、限制装料量 选不易产泡沫的菌种、调节培养基成分、机械消泡或化学消泡（5 5）湿度的影响）湿度的影响培养前期降低湿度，培养后期增加湿度。2.2.4 提高酶产量的措施提高酶产量的措施（1）添加诱导物）添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类 酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反应产物酶的催化反应产物 作用底物的类似物作用底物的类似物（2）控制阻遏物的浓度）控制阻遏物的浓度为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。（3）添加表面活性剂）添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂非离子型表面活性剂，如吐温（吐温（TweenTween）、特里顿特里顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。（4 4）添加产酶促进剂）添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度进剂的种类和浓度。微生物发酵生产法中尚待解决的问题微生物发酵生产法中尚待解决的问题 n 消除毒性 n 优良产酶菌种的筛选、培育 回本节2.32.3 酶生产过程的动力学酶生产过程的动力学2.3.12.3.1 酶生物合成的模式酶生物合成的模式2.3.2 酶生产过程中细胞生长动力学2.3.3 酶生产过程中产酶动力学2.3.12.3.1 酶生物合成的模式酶生物合成的模式通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型同步合成型，延续合成型延续合成型，中期合成型中期合成型和和滞后合成型。滞后合成型。同步合成型（同步合成型（生长偶联型）生长偶联型）酶的生物合成与细胞生长同步进行。酶的生物合成与细胞生长同步进行。大部分组成酶、部分大部分组成酶、部分诱导酶按照此种模式进行生物合成。诱导酶按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度 活细胞浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度延续合成型延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖的果胶为诱导物 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml中期合成型中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml滞后合成型（滞后合成型（非生长偶联型非生长偶联型）p在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合 成并大量积累。成并大量积累。如许多水解酶如许多水解酶。主要原因是主要原因是由于受到培养由于受到培养 基中存在的阻遏物的阻遏作用。基中存在的阻遏物的阻遏作用。若培养基中不存在阻遏若培养基中不存在阻遏 物，该酶的合成可以转为延续合成型。物，该酶的合成可以转为延续合成型。p该类型酶所对应的该类型酶所对应的mRNAmRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入稳定性很好，可以在细胞生长进入 平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放线菌素放线菌素D 对产酶的影响对产酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml3022不加加入不加加入回本节2.3.22.3.2 酶生产过程中细胞生长动力学酶生产过程中细胞生长动力学n细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。n细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。在培养过程中，在培养过程中，细胞生长速率与细细胞生长速率与细胞浓度成正比胞浓度成正比 假设培养基中只有一种限制性基质，而不存假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，在其他生长限制因素时，为这种限制性基质为这种限制性基质浓度的函数。浓度的函数。KS 为莫诺德常数，为莫诺德常数，是指比生长速率达到最是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。大比生长速率一半时的限制性基质浓度。回本节限制性基质的物料平衡式限制性基质的物料平衡式莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。各种动力学模型。连续培养时的方程变化形式2.3.32.3.3 产酶动力学产酶动力学 n产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律率的影响规律。n产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结非结构动力学构动力学。n也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学微观产酶动力学或称为结构动力学结构动力学。在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。细胞浓度以及细胞产酶模式有关。与生长相关与生长部分相关与生长无关回本节常用的几种模型常用的几种模型小小 结结n知识点：产酶微生物的种类、要求及应用n 酶的生物合成、调节、发酵生产n学习要求：掌握基本概念、了解相关进展n复习题：1.举例说明常见的产酶微生物的种类 及应用？2.酶生物合成的调节类型、作用机制？3.酶发酵生产的条件及控制的措施？1、中心法则-Central Dogma 2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白质的生物合成-TranslationGoGoGoReverse transcription1、中心法则-Central Dogma 2、RNA的生物合成(转录)-Transcription细胞内RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。(2)在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3)某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。(4)各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。转录过程的特点转录过程的特点1 1、转录的不对称性转录的不对称性：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二条链中仅有的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链反义链 antisenseantisense strand strand（无意义链，负链）：（无意义链，负链）：在在RNARNA的转录中，的转录中，用作模板的用作模板的DNADNA链称为反义链。链称为反义链。有义链有义链 coding strandcoding strand（编码链，正链）：（编码链，正链）：在在RNARNA的转录中，不的转录中，不作为模板的作为模板的DNADNA链称为有义链。链称为有义链。2 2、转录所需酶：、转录所需酶：依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶又称为转录酶，是以又称为转录酶，是以DNADNA为模板的一类为模板的一类RNARNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1 1种种RNARNA聚合酶催化所有聚合酶催化所有RNARNA的生物合成。而在真核生物中的生物合成。而在真核生物中RNARNA聚合酶有聚合酶有3 3种种，分别为，分别为RNARNA聚合酶聚合酶、RNARNA聚合酶聚合酶和和RNARNA聚合酶聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4 41010个，亚基种类有个，亚基种类有4 46 6种。种。转录过程n起始位点的识别起始位点的识别 recognitionrecognitionn转录起始转录起始 initiationinitiationn链的延伸链的延伸 elongationelongationn转录终止转录终止 terminationterminationn转录后加工转录后加工 modificationmodificationThe E.coli RNA polymerase holoenzyme consists ofsix subunits:a2 s.Possible catalytic subunitsPromoterspecificityEnzyme assembly,Enzyme assembly,Enzyme assembly,Enzyme assembly,promoter recognition,promoter recognition,promoter recognition,promoter recognition,activator bindingactivator bindingactivator bindingactivator bindingRole unknownRole unknownRole unknownRole unknown(not needed(not needed(not needed(not needed in vitroin vitroin vitroin vitro)36.5 36.5 kDakDa151151 15515511 11 kDakDa(32-90(32-90 kDakDa)3、蛋白质的合成(翻译)-Translation翻译翻译:以以RNARNA中中mRNAmRNA为模板为模板,按照其按照其 核苷酸顺序所组成的密码指核苷酸顺序所组成的密码指 导蛋白质的合成的过程导蛋白质的合成的过程.mRNAmRNA蛋白质蛋白质翻译翻译 各种信息各种信息 各种蛋白质各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）蛋白质的合成过程n肽链合成的起始肽链合成的起始 initiationn肽链合成的延伸肽链合成的延伸 elongationn肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放 termination and releasen合成多肽的输送和加工合成多肽的输送和加工 transport and modificationn蛋白质分子的折叠蛋白质分子的折叠 folding高效率的蛋白质合成体系本章目录酶生物合成的调节类型酶生物合成的调节类型转录水平的调节转录水平的调节转录产物的加工调节转录产物的加工调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译产物的加工调节和酶降解的调节等翻译产物的加工调节和酶降解的调节等A BEX底物水平底物水平的调节的调节酶水平酶水平的调节的调节 酶活性的调节酶活性的调节酶含量的调节酶含量的调节酶的定位调节酶的定位调节辅助因辅助因子调节子调节生长发育的不同时期生长发育的不同时期外界环境变化外界环境变化酶合成酶合成与分解速度的变化与分解速度的变化（基因表达调控）（基因表达调控）产物调节产物调节细胞内酶的调控模式n酶酶在在细细胞胞内内的的含含量量取取决决于于酶酶的的合合成成速速度度和和分分解解速速度度。细细胞胞根根据据自自身身活活动动需需要要，严严格格控控制制细细胞胞内内各各种种酶酶的的合合理理含含量量，从从而而对对各各种种生生物物化化学学过过程进行调控。程进行调控。n酶浓度调节的化学本质是基因表达基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。基因表达的调控主要在转录水平上进行。酶合成诱导的现象酶合成诱导的现象Jacob and Monod 的工作：的工作：已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；-半乳糖半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验一：实验一：1.1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；三种酶合成；2.2.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；消失；3.3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。本世纪三十年代，本世纪三十年代，H.Karstrom 在对糖代谢过程中的某些酶在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶诱导酶与组成酶某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进该酶编码的某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导酶合成的诱导。能诱导。能诱导酶合成的物质叫酶合成的物质叫诱导物诱导物。被诱导合成的酶叫。被诱导合成的酶叫诱导酶诱导酶。酶合成阻遏的现象酶合成阻遏的现象Jacob and Monod的工作：的工作：实验二：实验二：1.1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；2.2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。3.3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫合成的酶叫阻遏酶阻遏酶。乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构诱导机制诱导机制细菌乳糖操纵子的作用机制细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏降解物阻遏)调节基因调节基因 启动子启动子操操 纵纵基因基因 lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-CAP-cAMPcAMP复合物复合物mRNAmRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则则cAMPcAMP的浓度降低，的浓度降低，CAP-CAP-cAMPcAMP复合物减少，不能与启动子结合，故复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。转录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应过去称葡萄糖效应 本节目录调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达 调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构基因不能表达基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）色氨酸操纵子（酶的阻遏）-阻遏物和操纵基因的调节阻遏物和操纵基因的调节