流式培训-B27-封闭抗体复习过程.ppt

流式培训-B27-封闭抗体流式细胞术流式细胞术流动流动细胞细胞测量术测量术Flow Cytometry(FCM)Fluorescence-activated cell-sorting(FACS)流式细胞术流式细胞术流式细胞术流式细胞术快速检测流动的快速检测流动的单细胞或颗粒单细胞或颗粒，达上万个，达上万个/每秒每秒检测物可以是细胞、细菌或各种微粒，检测物可以是细胞、细菌或各种微粒，0.5-50 m mm范围内范围内 多参数同时分析多参数同时分析，FS/SS/FLs(荧光荧光)可分析，可分选可分析，可分选特特 点点特特 点：点：人类白细胞抗原系统（Human Leucocyte Antigen,HLA），俗称为白细胞血型，是人类的组织相容性抗原，HLA抗原受控于HLA基因。HLA基因是由一组高度多态性基因组成的染色体区域，因其产物代表移植供者与受者相互接受的程度，故又称其产物为移植抗原或组织相容性抗原。一、一、HLAHLA简介简介HLA基因遗传区域位于人类第六号染色体短臂，区域内包含224个基因座位,已发现的等位基因数共1288种。根据编码分子的特性不同，可将整个复合体的基因分成：I类、II类、III类。I 类基因：区位于着丝点的远端，主要包括HLA-A、B、C三个位点，各位点有数目不同的等位基因，HLA-B27是B位点的一个等位基因。II 类基因区：位于着丝点的近端，主要由DR、DQ、DP三个亚区构成，每个亚区又分若干个位点。在B细胞和上表达，这两类抗原都与移植有关 III 类基因区：含有编码补体成分C2、C4、B因子及TNF、热休克蛋白和21羟化酶的基因，其产物是一些可溶性蛋白质。一、HLA-B27HLA-B27抗原属于HLA-类抗原，由和两条肽链组成。第6号染色体的HLA-类基因编码链，15号染色体编码链。基本上表达在机体所有有核细胞上，尤其是淋巴细胞表面含量丰富。目前，在HLA与疾病的关联研究中，较有临床应用价值的当数HLA-B27HLA-B27与强直性脊柱炎的关联与强直性脊柱炎的关联。在诊断和鉴别强直性脊柱炎中有重要的应用价值。二、二、HLA-B27检测方法检测方法1.HLA-B27抗原检测CDC:微量淋巴细胞毒法FCM:流式细胞学法2.HLA-B27基因学检测荧光定量PCR（一）微量淋巴细胞毒法（一）微量淋巴细胞毒法1.原理原理：待检的淋巴细胞表面的HLA-B27抗原与已知的HLA-B27抗体结合，在补体的参入下，导致细胞膜溶解，能透过染料使细胞着色，在显微镜下判断HLA-B27为阳性，不着色为阴性。2.2.方法学应用评价：方法学应用评价：该方法结果稳定，可靠，不需要特殊仪器，是目前通用的方法，一般实验室均可开展。（二）流式细胞学法1.原理：利用荧光标记的抗B27的单抗与淋巴细胞表面B27抗原结合，使细胞带有荧光强度，用流式细胞仪检测，判断B27抗原阳性或阴性。2.方法学应用评价：优点：无须分离淋巴细胞，操作简便、快速、标本用量少，自动化程度高，特异性高，稳定性好，重复性高，结果判断准确，减少了人为因素的影响，为目前较为理想的方法。缺点:是仪器昂贵，目前只在较大医院应用。（三）荧光定量PCR1.实验原理：在PCR反应体系中，加入荧光染料，特异地掺入DNA双链后发射荧光信号，而不掺入荧光染料的DNA分子不会发射任何荧光信号，通过检测荧光信号的强度，达到检测PCR产物扩增的目的。2.优点：基因水平的检测，直接对HLA-B27原基因进行扩增分型，灵敏度高，特异性强。缺点：需要特定的实验仪器及严格的实验条件和熟练操作技术，在临床上普遍开展此项检查有一定的难处。四、HLA-B27检测与强直性脊柱炎应用评价1.普通人群中HLA-B27阳性率有种族与地区差异：不同作者报道不尽一致，白种人4%-13%，黑种人2%左右，日本人0.2%，中国人2%-19%。2.B27与AS强相关联，中国人AS患者HLA-B27阳性率65-100%。绝大多数B27阳性者并未患AS，所以，B27检测不可以作为AS的筛查指标。3.HLA-B27表达已成为临床诊断与鉴别诊断血清阴性脊柱关节病的最常用实验室检查指标。4.AS诊断主要靠临床检查和影像学改变，提示的双侧骶髂关节炎和脊柱炎。结合HLA-B27阳性，诊断AS。HLA-B27阴性不能排除AS。5.如果症状和体征脊柱关节病变发生的可能性超过50%，那么，B27阳性显著增加正确诊断的机会。6.一级亲属HLA-B27出现率25%-100%，预测患者家属成员发生AS的可能性。治疗性选择胎儿。7.AS与HLA-B27高度相关，表明AS是一种遗传易感性疾病。二、流式在封闭抗体中的应用二、流式在封闭抗体中的应用封闭抗体检测概 念为什么做什么做怎样做如何解读基本概念基本概念反复自然流产 自然流产连续或不连续发生2次或2次以上者，约占总妊娠数的0.5%3.0%病因 解剖因素、遗传因素、内分泌因素、感染因素、男方因素、免疫学因素（50%）RSA 自身免疫型：自身免疫型：与自身免疫病相关的自身抗体相关，如SLE、RA等 同种免疫型同种免疫型：封闭抗体，如：抗HLA抗体、抗滋养细胞淋巴细胞交叉反应抗原抗体（TLX）;非特异性BA、特异性非细胞毒抗体、抗独特型抗体等 主动免疫疗法所产生的BA部分是针对TLX的，因此，当夫妻双方TLX相似时，不能激发母体产生BA 封闭抗体的作用 1.一种抗配偶淋巴细胞的特异性IgG类抗体，存在于正常孕妇的血清中，能够抑制淋巴细胞反应，封闭母体淋巴细胞对胚胎滋养层的细胞毒作用。2.防止辅助性T细胞识别胎儿抗原的抑制物，并可阻止母亲免疫系统对胚胎的攻击。3.封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移动抑制因子。封闭抗体的作用父系抗原母体淋巴细胞封闭抗体没有封闭抗体胎儿不受母体攻击胎儿被母体攻击，导致流产封闭抗体检测方法封闭抗体检测方法-如何做如何做细胞毒试验ELISA流式细胞术流式细胞术检测封闭抗体流程标本：男女双方EDTA抗凝全血方法：室温孵育 裂解红细胞 上机 计算公式：封闭效率=对照管CD%-实验管CD%结果判定：1.三项中有一项出现负值即判断封闭抗体缺乏 2.封闭效率均为正值，判断阳性，正常 男方全血男方全血男方血浆男方血浆 女方血浆女方血浆 混合单抗混合单抗对照管10010020实验管10010020如何解读封闭抗体机制研究奠定了封闭抗体治疗有效性安全性的理论基础我们检测：抗淋巴细胞表面的CD3、CD4和CD8抗体，如何从免疫学机制上解释？封闭抗体缺乏怀孕生产，所以对于封闭抗体检测的临床参考值提出挑战。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢