分子生物学(基因工程)15.doc

优质文本基因工程原理 第一章 绪 论 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程、微生物工程共同组成了生物工程第一节 名 词 概 念一、基因gene 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型genotype，phenotype，可以由于突变生成等位基因变异体体细胞父源和母源；正常和突变基因；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。二、基因工程genetic engineering 在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。 基因工程技术的核心是DNA重组技术。一DNA重组DNA recombination 不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。 二DNA克隆DNA clone 在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞进行大量复制扩增，最终获得大量同一的DNA分子。亦称分子克隆。基因工程的根本特点l 分子水平上操作、细胞水平上表达277次实验诞生的辛运羊苏格兰科学家利用6岁成年母羊乳腺细胞  1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。复制人？2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。2002年12月，法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。2003年，5月意大利宣布克隆成功克隆马“普罗梅泰亚世界上首次由哺乳动物生下自己的克隆体，即是母女、又是姐妹关系 。2003年，12月美国德州农业机械大学宣布克隆成功白尾鹿。2005年，12月韩国克隆狗斯努皮Snuppy中。 基因工程具有的重要特征第一个重要特征：外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系。第二个重要特征：一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品"拷贝"出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯洁的DNA分子群体。第二节 发 展 历 程一、基因工程诞生的根底l 理论根底l 证实DNA是遗传物质l DNA双螺旋结构模型及复制机制l 遗传密码的破译及遗传信息的传递l 技术根底l 限制性内切酶的发现与应用l DNA连接酶的发现与应用 基因工程载体的研究与应用二、基因工程的里程碑l 1972年美国斯坦福大学P.Berg 将SV40的DNA导入噬菌体载体在大肠杆菌中获表达l 1973年S.Cohen等人将抗四环素、抗新霉素基因的质粒转化大肠杆菌，获得抗四环素、抗新霉素重组菌落，从而揭开基因工程的序幕三、 基因工程大事记1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因烟草1986年首次批准转基因烟草进行田间试验用基因技术培养的西红柿，它成熟后不会很快软化，便于运输和储藏 1994年美国批准耐储藏转基因番茄进入市场 2000年人类培育出的第一只转基因猴“安迪。意味着克隆人已没有技术障碍1982年首次通过显微注射法培育出世界上第一个转基因小鼠第三节 应 用 及 前 景一、基因工程研究的内容l 根底研究新技术、新方法的研究；工具酶的开发；基因文库构建等l 载体研究克隆载体；表达载体l 受体细胞研究大肠杆菌；酵母、高等植物、动物细胞目的基因及基因组研究l 应用研究转基因动、植物；生物工程药物等二、基因工程的意义及目的l 大规模生产生物分子：酶、抗体、疫苗、细胞因子。l 改造或新建物种：转基因动、转基因植物、基因治疗。l 基因结构、功能分析，获取遗传信息资源 这一技术将跨越生物种属界限、简化生物物种进化程序、缩短生物进化速度、提高人类生活品质。转基因动物以DNA重组技术将一外来基因植入动物染色体中的一种技术乳腺发生器我国首批28只带有t-PA组织型纤溶酶原激活剂的转基因羊第三只眼 人造眼的未来？转入生长激素基因大鼠美国密苏里大学通过克隆技术培育出四只含有荧光水母基因的小猪美科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶可当宠物出售的转基因荧光鱼荧光转基因动物缺乏胆固醇的转基因小鼠荷兰公司培养出带有人类基因的奶牛基因奶牛生产的牛奶中，富含人类乳铁传递蛋白转基因植物通过基因工程创造的新物种具有害昆虫抗性的转基因植物 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 其所产生晶体蛋白有杀害昆虫的能力。 以基因重组技术将该蛋白基因转入植物的染色体中,使转基因植物具有抗有害昆虫的能力, 因此可以減少化学农药的使用。对照抗虫稻 对照转基因抗棉铃虫品种 基因工程培育抗虫棉单价抗虫棉：Bt苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因CryIA； 双价抗虫棉：CryIA 及 CpTI豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，更持久抗虫。转基因康乃馨、矮牵牛 具病害抗性的转基因植物 将有抗植物病毒(resistance against plant viruses)的基因转入植物中,可使转基因作物获得抗植物病毒的能力。转基因作物有: 烟草(tobacco)，蕃茄(tomatoes)和马玲薯(potatoes)等. 具抗除草剂的转基因植物 将有抗除草剂的基因(Genes for resistance to herbicides)转入作物以增强其对除草剂(weed killer)的存活能力.利用抗草甘膦glyphosate E. coli中别离克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。具耐高盐度的转基因植物 科学家已培养出能在盐度高的土地中生长的转基因番茄株(transgenic tomatoes)，转基因番茄可将过多的盐分排出, 因此并沒有多余的盐份(excess sodium)残留在果实中。其他在市场出售的转基因作物l 油菜仔、木瓜 、南瓜 、马铃薯、番茄、玉米 利用生物技术培育的欣赏花卉蝴蝶兰已经绽开了美丽的花朵 通过转基因技术已育成稻米胚乳中含有胡萝卜素的“黄金稻Ye等，Science，2000，28714生产乙醇的大肠杆菌三、基因工程研究的现状一各国研究状况二应用和成就三我国基因工程制药业开展 2006年种植面积超过400万公顷的作物有：大豆5860万hm2，约占全世界转基因作物的57%，均为抗除草剂大豆、玉米2520万hm2，约25%、棉花1340万hm2，约13% 、油菜480万hm2，约5% 。 花生、向日葵、亚麻、甘蓝、烟草、马铃薯、番茄、甜菜、南瓜、小麦、亚麻、木瓜、罗马甜瓜、菊苣、匍匐剪股颖和苜蓿等转基因作物已实现商品化。在细菌中表达 人的胰岛素1982年，是最早应用基因工 程生产人的蛋白质基因工程应用大肠杆菌 生产人类生长激素 已在细菌中生产10多种 药品，例如表皮生长因子、人 生长激素因子、干扰素、乙型 肝炎工程疫苗等。目前，酵母菌、植物悬浮 细胞、植株和动物培养细胞均 成功地应用于表达外源蛋白。 2005年我国转基因作物面积330万hm2。 至2006年，我国已受理稻、麦、棉、豆、玉米、油菜、牧草等转基因生物平安评价申请1525项，共批准中间试验456项、环境释放211项、生产性试验181项、平安证书424项。已获得商业化生产应用平安证书的作物：耐贮藏番茄、改变花色矮牵牛、抗病毒甜椒、抗虫棉花占全国>60%、抗病毒番木瓜等 5 种已批准商业化种植的转基因植物。     至2016年我国已批准商业化种植的产品有25种，其中1种转基因大豆、8种转基因玉米、1种转基因番茄、 7种转基因油菜、2种转基因棉花，以及改变花色矮牵牛、抗病毒甜椒等转基因植物。 l 国家中长期科学和技术开展规划纲要20062020年中，把生物技术列在今后15年8大前沿技术领域之首。l 我国生物技术开展根本思路：加强原始创新和源头创新，获得具有自主知识产权的技术和产品，集中攻关，实现跨越开展；市场导向，促进生产。l 关键技术：生物工程技术、基因操作技术、生物信息技术、现代农业技术第四节 问 题 和 疑 惑基因产品平安吗？伦理问题l 是否任何可以做成的事情都应该去做?l 人类是否可以随便改造生物的基因？l 经过生物科技改造的基因,生物或过程是否可享专利权保护?l 基因治疗的伦理问题,治疗或改进 ?l 是否能用人类胚胎细胞来做实验工具?l 基因信息与人类隐私权?l 复制生命是福？ 是祸？何谓复制人？ 以无性生殖方式，人类以自身的一个己分化和具和二十三对染色体的体核细胞，通过电击与一去核卵融合，培育出一个与自身具有相同基因的胚胎所复制出来的人复制人的伦理争论1.对生命尊严与制造生命的伦理意义2.复制技术尚未真正测试和完善化，可能产生的各种畸型生命的风险极高3.原型人与复制人彼此沒有自我的独特性，在心理上产生不良反响的自我认同问題4.复制人的家庭伦理定位复制技术的主要争论点1.平安顾虑2.自我认同和个体性3.复制人的父母对复制人的控制4.人类的物品化5.改造人类基因的优生学6.个人生育选择的自由7.人类基因的多样性l 平安顾虑l 成功率太低赞成1复制技术可以去除先天的基因缺陷，反而更平安 2染色体端粒假說不是绝对的，有很多相反的例子反对1成功率太低2至今沒有重复操作成功所累积的大量案例可供确认平安性 3根据染色体端粒假說，出生 的复制羊已经和原母体一样老l 个体性和自我认同 赞成：复制人就是一个完整的人，和双胞胎一样，基因相同并不影响其自我认同 反对：基因确实是人类独一无二的重要表征，复制人的个体性自始被剥夺l 生物多样遭破坏 赞成：同一人的基因不会被大量复制，何況真正消灭传染病的是医学开展，不是生物多样性反对：复制破坏基因的变化，使人失却抵御病毒、流行病、细菌及环境变迁的能力l 生殖权赞成：复制是生殖权的一局部，人可以有“特別的人工协助生殖方式，也可以积极地筛检基因反对：权利也可以有适当限制什么样的情况可以复制人？器官移植、重塑逝者、生命延续？案例1： 某甲30岁生了个儿子 20年后甲因飞机坠机过世，家人利用基因复制一个甲。Q 1：复制甲的社会伦理地位为何？此20岁儿子如何称呼甲 (爸爸？)Q 2：复制甲的法律地位为何？儿子与复制甲如何分配甲过世后所留的遗产 ？案例2： 因被复制者的遗传基因(DNA)与原來个体相同，假设未来复制人犯了强奸杀人罪，现场仅留有血液及精液等样本。Q：警方如何厘清复制者与被被复制者的关系 ？道德问题l 无论是蓄意或无心闯祸制造病毒或其它有害的生物l 以牟取利益或功利为目的l 违背人自身价值和自由转基因植物对自然物种所造成的潜在性风险与危机l 在作物中对除草剂有抗性的基因可能会在自然环境中转入杂草品种中，这将会造成日后难以处理的困难l 杀虫蛋白基因假设在花粉中表达将危及赖以为生的蜜蜂等有益昆虫案例：在种植抗除草剂作物后，屡次喷洒除草剂，杀死杂草而对作物无威胁。由于大斑蝶的惟一的食物是马利筋，随着屡次除草剂的喷洒，马利筋就大量减少，也就威胁到大斑蝶的物种的生存。结束语1承認人所知有限 目前科技人对自己的了解仍是非常浅薄的，目前多在基因所控制生命現象的层次。母爱的力量可否量化？2人非胜天，需順从自然规律，以免造成大自然的反扑人类的威胁不是来自可能致命的机器和技术工具；真正的威胁总是戕伤个人的本质。海德格生物科技的开展会使我们丧失人性？科技本身是中性的，由人操控決定未来，它可给人类无穷的幸福，也可带来万劫的灾祸我们是谁，要往何处去？第二章 基因工程工具酶 在基因工程中需要一些酶对DNA进行剪切、连接、修饰、合成等操作，这些酶即称为工具酶。主要的工具酶有：l 限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酶、T4噬菌体激酶、末端转移酶Taq DNA聚合酶第一节 限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶定义 简称限制酶。是一类内切核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列。细菌的限制修饰系统l 限制-修饰系统存在于原核生物，通过限制性内切核酸酶破坏进入细胞的异源DNA，这个现象叫做“限制 ；通过甲基化作用使DNA得以防止受酶活性的影响，这个过程叫做“修饰。l 细菌中已发现三类限制-修饰系统：类、类、类。三类限制修饰系统l 类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子。l 类由两种酶组成的二元系统，一种为限制性内切酶，另一种为甲基化酶两种酶识别序列相同基因工程中常采用缺少限制作用的菌株作为受体细胞，保证基因操作的顺利实施。l 细菌大肠杆菌K12限制与修饰系统的4种遗传表型：l rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修饰功能l rk-mk+：突变株，限制缺陷型，常用于转化实验l rk-mk-：限制和修饰缺陷型，常用于转化实验rk+mk-：修饰缺陷型，具有限制功能，又称“自杀性表型二、限制性核酸内切酶作用特点 一分类根据酶的分子组成及裂解方式的不同，将限制性内切酶分为三类：1.类和类限制性内切酶 在DNA重组技术中并不常用2.类限制性内切酶 通常所说的限制性内切酶即指此类表 限制性核酸内切酶的类型及其特性二命名 通常由三个斜体字母表示 1.第一个大写字母为微生物属名的第一个字母 2.第二、三个小写字母为微生物种名的头两个字母 3.如有株名那么再加一个字母 4.用罗马数字表示同株内发现和别离顺序 例如: 淀粉液化芽胞杆菌Bacillus amyloliguefaciensH株 第1种限制性内切酶，命名为Bam Hl Escherichia coliRY13株，首次别离到的内切核酸酶，称为 ？ 。Haemophilus influenzaeRd株，第三个被别离到的内切核酸酶，称为 ？ 。(三)类限制性核酸内切酶识别序列特点回文结构：切口 ：平端切口 - 平末端 粘端切口 - 粘性末端异源同功酶：来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。Subsets酶一个位点包含在另一个位点之中 Hpa识别及切割序列：CCGG Sma识别及切割序列：CCCGGG Sma能识别与切割的6个bp中，含有Hpa的CCGG识别与切割位点四限制性内切酶的应用 l DNA重组克隆及亚克隆l 改造和构建质粒l 组建基因组DNA物理图谱l 基因组DNA同源性研究l DNA杂交l DNA序列分析DNA的物理图谱physical map 又称DNA限制酶酶切图谱restriction map。它由一系列位置确定的多种限制酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。DNA限制酶酶切图谱构建 通常结合使用多种限制酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。建立限制酶酶谱的意义 用于DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建、RFLP(限制性片段长度多态性)技术应用等方面五限制酶的活力单位和星活力1.酶活力单位2.星号活力3.酶切体系建立 酶活力单位 在适宜温度、pH值和离子强度等条件下，1小时内完全消化1g特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。 星号活性 限制性内切酶在非标准反响条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加 “* 表示诱导星活性的因素l 高甘油含量>5，限制酶贮存在50%甘油中；l 内切酶用量过大>100UugDNA；l 低离子强度<25mmol/L；l 高pH>8.0；l 含有机溶剂二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇、二甲基乙酰胺等；l 二价阳离子Mn2、Gu2、Co2、Zn2三、酶切体系建立 总反响体积20100ul： 例： 底物DNA 1ug 限制酶 1活性单位 缓冲液 1×NEBuffer 蒸馏水 至20ull 对于大量DNA的酶解，反响体积可按比例适当扩大。l 参加过量的酶，可以缩短反响时间并到达完全的酶解，但同时增加的甘油含量会影响反响，导致识别序列的特异性下降。l 一般推荐稍过的酶25倍和较长的反响时间。l 在保证酶液体积不超过反响总体积的10%的前提下，尽量减小反响总体积。l 限制酶的质量要求：l 不存在其他核酸内切酶及外切酶的污染；l 长时间酶切不出现非特异顺序识别；l 在建立反响体系时，最后参加酶；l 分装储存，防止反复冻融；l 稀释的酶应尽快用完DNA的质量要求： 纯度要求应当去除酚、氯仿、乙醇、去污剂或过多盐离子的污染，EDTA含量不能大于10mmol/L ，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化、大量RNA杂质、某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。 浓度要求DNA浓度在1ug/20ul能得到较好的酶切效果，浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。 DNA分子的构型超螺旋质粒DNA、病毒DNA酶解所需的酶量更高甲基化酶 影响限制酶的酶切活性有dam甲基化酶和dcm甲基化酶。基因工程中使用甲基化酶缺失的大肠杆菌菌株制备质粒DNA载体。 特殊用途改变限制酶的识别序列GTCGAC可被R.Hind识别切割，如A被甲基化那么将改变其切割特异性产生新的限制酶识别序列 保护限制酶的切点 一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，可用于研究DNA位点专一性甲基化程度和分布 CCGG可被Hpa和Msp识别，mCmCGG那么只被Msp 识别酶切缓冲液NEBuffer的质量要求：l EBuffer中应含Mg2作为限制酶的激活因子；l Tris-HCl，将酶反响体系的pH维持在7.5-8.5之间；l 参加DTT和BSA用于保护酶活性；l NaCl提供适宜的离子强度，每种酶都有最适的离子强度。操作的考前须知： 1限制性内切酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，防止长时间置于高温中。 2限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，参加反响管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分混匀。 3加样时吸头垂直进入试剂管，防止碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，防止污染。 4酶置于冰盒上应最后参加，加酶时吸头不可过深。 酶切容积 酶反响体积一般不宜小于20ul。可分为小量酶切反响和大量酶切反响。小量酶切反响主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 l, 含0.21g DNA；大量酶切反响用于制备目的基因片段，体积为50100 l，DNA用量在1030g。酶解温度及时间 常规的酶切反响一般控制在37、1小时内完成，但也可以根据切割对象与所用的酶的不同调整反响温度或延长保温时间以到达完全酶切。终止反响参加EDTA至终浓度10mmol/L，络合镁离子。但这种方法会影响需镁离子的后续反响。将酶切反响液置于6585保温20分钟。热失活方法简单、未向体系中引入任何物质，特别适用于连续进行几个酶切反响。酚氯仿抽提沉淀，能使酶彻底失活。酶切结果鉴定 酶切完毕，取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。第二节 连 接 酶酶定义 催化双链DNA中相互邻近的5磷酸末端和3羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNA双链中的切口或将二个DNA分子连接起来。 DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而难于将二个单链DNA分子连接。二、连接酶的种类l 种类：T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶，前者的连接效率高于后者。l 特点：T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端的DNA分子；大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端 DNA分子l 应用：DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶l 条件：连接反响需要ATP、Mg2+ 和二硫苏糖醇，最适pH为7.27.4三、反响体系建立一T4DNA连接酶的活性单位几种酶单位的定义1.韦氏单位Weiss：指在37下20分钟内催化1nmol 32P从焦磷酸根置换到- 32P ATP所需的酶量2.M-L单位Modrich-Lehman：使用dA-Tn作为底物3.粘性末端连接单位：以DNA/Hind 片段为底物l 各单位之间的换算关系l 1韦氏单位=66.6粘性末端连接单位l 1韦氏单位=0.2M-L单位0.01韦氏单位能在16、30分钟内将Hind 完全酶解的1 g DNA片段完全连接二反响总体积 50 lT4噬菌体DNA连接酶 1 Weiss单位ATP 0.51.0mmol/LDNA 1.0 g (0.11.0mol/L5末端)10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 5 l缓冲液组分：Tris-HCl pH7.6;MgCl;DTT;BSA三反响条件粘性末端：温度 1216 时间 116小时平末端：更大量的连接酶10100倍、较多的底物浓度、适量的一价阳离子、低浓度PEG、ATP终浓度0.5mmol/L较高的反响温度30四终止反响1.参加2 l 0.5mol/L EDTA 溶液2.75 水浴 10分钟四、影响连接反响的因素一DNA末端的浓度影响连接物的分子构型两种产物构型1.线性DNA连接物：不同分子DNA的两个末端首尾相连形成线性分子2.环状分子：同一分子的两个末端连接形成环状分子。分子构型与DNA浓度、长度的关系1.一定浓度、小分子DNA片段，同一分子环化趋势大2.长度一定的DNA分子，浓度降低有利于分子的环化3.浓度较高的DNA,有利于分子间的连接，形成线性二聚体或多聚体分子4.两种以上DNA分子连接，其末端浓度比例将影响重组分子的形成通常外源DNA的末端浓度大于载体末端浓度2倍二反响温度l 粘性末端连接：一般为1215l 兼顾粘性末端退火、酶活性、反响速率；l 连接温度介于同源粘性末端退火最适温度和酶的最正确反响温度之间；l 粘性末端中G+C含量多，其连接温度可以增高l 平末端连接：可在室温下进行。但温度高于30会导致T4DNA连接酶不稳定。三其他l ATP浓度：对酶的催化活性影响很大，在ATP浓度为0.55mmol/L范围内，随着ATP浓度的升高对T4DNA连接酶产生可逆性抑制；当ATP浓度7.5mmol/L时，对T4DNA连接酶的粘性末端及平末端连接活性均有抑制作用。l NaCl浓度：当NaCl浓度150mmol/L，将严重阻碍T4DNA连接酶的连接效率第三节 其 他 酶1.逆转录酶2.Taq DNA聚合酶3.T4多核苷酸激酶4.末端转移酶5.碱性磷酸酶6.DNA聚合酶7.Klenow片段DNA聚合酶大片段l 1.DNA聚合酶 l 合成双链DNA分子l 缺口平移法，获得高比活性探针l DNA序列分析补平3端 l 2.Klenow片段DNA聚合酶大片段l 具有完整的DNA聚合酶活性l 保存35外切酶活性l 无53外切酶活性l Klenow片段的主要应用于：l 合成cDNA第二链l 补齐双链DNA分子3端或标记3端DNA序列分析3.T7噬菌体DNA聚合酶l 具有很强的持续聚合能力，可连续合成上千个核苷酸的DNA片段；l 具有很强的35外切酶活性为Klenow酶的1 000倍l 在分子克隆中的用途：l 用于催化大分子模板M13噬菌体DNA的引物延伸l DNA分子3末端标记修饰去除35外切酶活性后用于体外诱变中合成第二链以及链末端终止法测序又称测序酶4.逆转录酶 l 以RNA为模板逆转录合成cDNA5.Taq DNA聚合酶l PCR扩增目的DNA片段l DNA序列分析目的DNA片段3端加A，用于AT克隆6.末端转移酶脱氧核苷酸末端转移酶 l DNA片段3端加上同聚物尾l 标记DNA片段3端7.T4多核苷酸激酶 l 催化多聚核苷酸5端羟基磷酸化l 标记探针5端8.碱性磷酸酶 去除多聚核苷酸5端磷酸基团末端转移酶的功能幻灯片141碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶标记法9.核酸酶核糖核酸酶：作用于RNA 脱氧核糖核酸酶：作用于DNA 核酸酶：作用于RNA及DNA几种核糖核酸酶的特性脱氧核糖核酸酶、S1核酸酶的特性几种核酸外切酶的特性利用核酸外切酶产生嵌套缺失体利用两种限制性核酸内切酶消化克隆有靶DNA片段的载体；核酸外切酶处理不同时间，并用S1核酸酶削平末端；重新环化Bal 31外切酶的作用：a.单链DNA的内切作用；b.3外切酶活性和5内切酶活性；c.DNA超螺旋结构的线性化作用第三章 基因工程载体一、载体vector的概念 是一种运载工具，携带靶DNA目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。二、载体构建和选择的条件1.自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力2.适宜的限制性酶切位点供外源DNA片段插入3.具备可筛选的标记，常用的有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等4.分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数5.配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等三、载体的种类及来源l 常用的载体：一、根据载体的来源分为l 质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等 二、根据其用途不同分为：l 克隆载体cloning vector表达载体expressing vector四、几种常用的载体l 一质粒载体l 质粒载体是应用最广的载体；质粒载体大多是在天然松驰型质粒的根底上经人工改造拼接而成；质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制理想质粒载体的特点： 1.松驰型复制子如ColE12.几个单一的酶切位点或多克隆位点3.插入失活的筛选标志：具有两种抗生素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr等。4.分子量相对较小和拷贝数较高缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNApBR322质粒载体的特点：1.带有一个复制起始点ori 2.抗生素抗性基因Ampr和Tetr作选择标志3.数个单一的限制性酶切位点 l 典型的pUC质粒载体有4个组成局部：l 来自pBR322 质粒的复制起始点l Ampr基因l 大肠杆菌-半乳糖苷酶基因LacZ启动子及编码-肽链的DNA序列LacZ基因l 多克隆位点位于LacZ基因中靠近5端pUC18质粒载体分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；酶切位点多，克隆方便；具有-互补显色表型,便于检测。 二噬菌体载体 噬菌体严格依赖于细菌宿主细胞生长与繁殖，由外壳蛋白质与内部双链线性DNA分子组成。按生活周期可分为溶菌性噬菌体和溶原性噬菌体。作为载体的特点：有效地感染细菌，克隆的产量较高。噬菌体结构l 噬菌体载体的种类：噬菌体载体、粘粒载体称柯斯质粒cosmid、单链丝状噬菌体载体 gt10插入型结构三穿梭载体l 同时具有原核和真核细胞的复制起始点l 真核生物的克隆载体常构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩增，再转入真核细胞l 假设加上适当的真核启动子等元件，那么成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因l 真核系统载体还必需具备适当的筛选标记 使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补如TK基因产物、抗新霉素基因SV40猿猴病毒载体逆转录病毒载体例：PSVK3质粒 PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。PSVK3具有以下构件1.原核系统构件l 复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl、筛选标志Ampr、启动子T7启动子2.真核系统构件l SV40复制起始点、SV40早期启动子3.RNA修饰信号l SV40小T抗原拼接信号、SV40早期区mRNA polyA加尾信号4.多克隆位点SV40启动子下游有8个酶切位点l 逆转录病毒载体的特点：l 具有广泛的哺乳动物细胞宿主；较大的容量，能插入7kb甚至更大的外源基因；病毒基因组自身含有完整高效的调控元件；病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在；逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系l 逆转录病毒载体的局限性：l 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞外表的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞l 装载容量较小，仅8kb左右l 可能存在具有复制能力的野生型病毒卸甲载体 常用外源DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为disarmed vector。 四人工染色体载体l 酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC、噬菌体P1衍生的人工染色体PAC、哺乳动物人工染色体MAC YAC主要调控元件l 着丝粒：保证染色体细胞分裂过程中正确分配到子代细胞l 端粒：防止染色体被核酸外切酶降解l 复制起始点和限制性内切酶位点l 原核序列及调控元件：大肠杆菌ori、AmprYAC的筛选标志：酵母中一般通过色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选YAC作为载体的主要特点：l 酵母是单细胞真核生物，培养方便；酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因；装载容量大，可达Mbp水平；DNA片段连接到YAC载体的两臂上形成重组体，将重组体通过常规方法导入酵母；已广泛应用于各种生物基因组方案第三节 DNA重组与鉴定DNA重组过程将不同来源的DNA分子进行特异地切割获得的目的基因或DNA片段与载体连接重组的DNA分子导入相应的宿主细胞在宿主细胞中进行无性增殖基因工程根本程序一、目的基因的获取l 获取的方法有：1.限制性酶切2.PCR扩增目的基因片段3.通过基因文库筛选4.通过cDNA文库筛选5.人工合成DNA片段二、目的DNA片段与载体的连接l 粘端连接法；l 平端连接法：平接法； 人工接头法；同聚体加尾连接 同聚体加尾连接 人工接头连接三、重组DNA分子导入宿主细胞l 宿主细胞选择：原核细胞大肠杆菌、真核细胞(哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞)l 重组DNA分子导入宿主细胞方式：转化、转染和感染转化l 将重组的DNA分子导入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化。l 转化的方法可分为CaCl2法和电穿孔法。 感受态细胞：细菌在生长过程中处于能接受外源基因的状态称为感受态细菌。处于感受态的细菌外表正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，有利于DNA分子的吸附和吸收。CaCl2法：当细菌处于0、二价阳离子Ca2+低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞外表，在42短时间热冲击后DNA进入细胞转化效率为每微克DNA可获得105106转化子电穿孔法：利用高压脉冲，在细菌细胞外表形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入细胞 转化效率高，每微克DNA可得到109 1010转化子转染l 将外源DNA直接导入真核细胞的过程称为转染l 常用的方法： 电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体法、DEAE-葡聚糖介导、显微注射法等l 磷酸钙共沉淀法：将被转染的DNA和溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性DNA形成沉淀颗粒附着在细胞外表，在钙、磷的诱导下通过内吞作用被细胞摄取。l 脂质体法：是一种带有正电荷的人造膜泡，与DNA或RNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹DNA的颗粒。 脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。l 显微注射法：将外源基因的重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中并进行表达，但显微注射法需要一定的仪器和操作技巧。 感染l 重组DNA分子在体外包装成具有感染能力的噬菌体或病毒颗粒，然后感染适当的细胞，这种使用噬菌体或病毒将重组 DNA分子导入细胞的方法为感染l 效率较高，每微克可得到10