独活提取物抑制柑桔病原真菌活性成分的分离与鉴定投稿1116.doc

独活提取物抑制柑桔病原真菌活性成分的别离与鉴定李敏敏1.2，胡军华1,工程资助：国家科技支撑方案2006BAD22B03-B4；重庆市自然科学基金CSTC,2021BB1272作者介绍：李敏敏，女，硕士研究生，植物源杀菌剂方向通讯作者 ：胡军华， ：02368349005， E-mail: dhujhyahoo ，贺磊1，2，姚廷山1，冉 春1，李鸿筠1，刘浩强11 西南大学柑桔研究所，2 西南大学园艺园林学院；重庆,400712摘要：采用生长速率法、溶剂萃取、硅胶柱层析、气相色谱-质谱联用GC-MS等方法研究独活乙醇提取物对3种柑桔贮藏病害病原真菌的抑菌作用，并别离和鉴定其抑菌活性成分。结果说明，独活乙醇提取物对3种柑桔病原真菌均有很好的抑制效果，对柑桔炭疽菌的抑制效果最正确。GC-MS鉴定B2组分中含有4种香豆素类化合物异佛手柑内酯、牛防风素、茴芹内酯、异茴芹内酯。异佛手柑内酯、茴芹内酯、异茴芹内酯三种化合物对柑桔炭疽菌的EC50均在40-50ug/ml之间，其中茴芹内酯的抑制活性最好，其EC50为41.5216 ug/ml。光学显微镜下观察发现，茴芹内酯处理会导致病原菌菌丝体分支增多，菌丝畸形等变化。关键词：独活；抑菌活性；别离鉴定Isolation and identification active ingredients of Radix Angelicae Biseratae extracts against citrus fungus pathogens LI Min-min1,2 , HU Jun-hua1, *, HE-Lei1,2, YAO Tin-shan1, RAN Chun1 , LI Hong-jun1, LIU Hao-qiang1(1.Citrus Research Institute, Southwest University. 2.College of horticulture and landscape architecture, Southwest University; Chongqing ,400712,China)Abstract:The antifungal activity of ethanol extract and active ingredients of Radix Angelicae Biseratae were studied by using mycelial growth, Solvent extraction, column chromatography and GC-MS analysis. The results showed that the ethanol extract presents the highest inhibitory activity against Colletorichum gloeosporioides. B2 active ingredients were analyzed by GC-MS and the results showed that bioactive compounds of ethanol extract of Radix Angelicae Biseratae has 4 compounds i.e isobergapten, sphondin, pimpinellin and isopimpinellin. Antifungal virulence of isobergapten, pimpinellin and isopimpinellin was 40-50ug/ml and the EC50 of pimpinellin was 41.5216 ug / ml, best in three compounds. Pimpinellin could induce C.gloeosporioides to become more mycelium branches, deformity and so on. Keywords: Radix Angelicae Biseratae ; antifungal activity; Isolation and identification柑桔贮藏期间易发生多种病害，最重要的是青霉病和绿霉病，其次是炭疽病、黑腐病、褐色蒂腐病等，常引起果实腐烂，严重影响贮藏及外销，造成重大的经济损失1。生物农药具有无公害、低残留、高平安性、高生物活性及高选择性的特点，逐渐替代合成化学农药成为开展的必然趋势，其中，植物源杀菌剂为生物农药研究热点之一。地球植物资源丰富，其产生的次生代谢产物超过40万种2。种类繁多的植物次生代谢产物是开发植物源杀虫、杀菌剂的物质根底。独活Radix Angelicae Biseratae为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim. fbiserrata Shan et Yuan植物，主要产于湖北、四川及江西等地。独活性微温，味辛、苦，具有镇痛、抗炎、抗癌等生物活性，其主要活性成分为香豆素，挥发油等3,4。范莉等5发现独活挥发油具有良好的抗炎作用和镇痛效果。独活中的异补骨脂素6、东莨菪素7具有抗癌作用。本试验研究了独活提取物对柑桔3种病原真菌的抑菌活性，并进一步别离纯化、鉴定其活性成分，以从中寻找具有开发价值的杀菌剂先导化合物。1材料与方法1.1 供试材料独活：购于四川省成都市荷花池中药材市场。99.72%异佛手柑内酯(isobergapten) 、99.50%异茴芹内酯(isopimpinellin)购自上海源叶生物科技。99.86%茴芹内酯(pimpinellin)购自上海融合医药科技开展。1.2供试病原真菌柑桔青霉菌Penicillium italicum、柑桔绿霉菌Penicillium digitatum、柑桔炭疽菌Colletorichum gloeosporioides由西南大学柑桔研究所提供。1.3 试验方法1.3.1 植物材料预处理将独活根置于60烘箱烘干，粉碎后过40目筛孔径0.37mm。所得植物粉用密封袋遮光保存备用。1.3.2 独活粗提取方法超声波提取：称取植物样品20 g置入500 mL三角瓶中，参加200 mL 70%乙醇，58超声提取40 min，减压抽滤，重复3次。合并三次滤液，高压真空过滤后，58旋转蒸发浓缩成膏。称取提取物的重量，用以下公式计算提取率：提取率(%)=提取物的质量(g)/样品干重(g)×1001.3.3 独活乙醇提取物对3种柑桔病原菌的室内毒力测定将待测提取物用少量乙醇溶解，参加适量无菌水配制成一定浓度的供试药液，在9 mL PDA培养基中参加1 mL药液，配制出0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL带药PDA平板培养基。将各病原菌菌饼直径为6 mm分别接种于平板中央，每皿接1个菌饼，每处理3个重复，同时以参加等体积乙醇至无菌水作为对照。28 培养72h，采用十字交叉法测定菌落直径。使用DPS软件计算毒力回归方程、有效中浓度(EC50)及相关系数。1.3.4 独活乙醇提取物活性成分的别离纯化将独活乙醇提取物用5倍热蒸馏水溶解，分为有机相和水相，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次萃取。将所得有机相中石油醚萃取液A、乙酸乙酯萃取液B和水相中石油醚萃取液C、氯仿萃取液D、乙酸乙酯萃取液E分别减压浓缩，称量后，配制成质量浓度为1mg/mL带药培养基，按1.3.3方法对各组分进行抑菌试验，计算抑制率。抑制率%=对照组平均菌落直径处理组平均菌落直径/对照组平均菌落直径×100采用硅胶200-300目柱对有机相中乙酸乙酯萃取部位B进行别离纯化，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱1:0、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、0:1，各洗脱液为150 mL。将收集的各馏分进行减压浓缩后，参照1.3.3，配制质量浓度为1mg/mL带药培养基，对各组分进行抑菌试验，计算抑制率。1.3.5 活性成分的气相色谱质谱联用分析GC-MS气相色谱条件GC：色谱柱：HP-5MS30m×0.25mm×0.25m film石英毛细管柱；柱温采用程序升温方式：80保持10min，然后以3/min程序升温至240，保持10min；平衡时间：1.00min；载气：氦气，1.0mL/min，恒流模式；进样口温度：250；进样量：1L；进样方式：不分流进样， 0.5min后翻开分流阀和隔垫吹扫阀；隔垫吹扫：1.0mL/min；分流出口吹扫流量：30 mL/min在0.5min。质谱条件MS：自动调谐；溶剂延长时间：3min；质量数：35.0-500.0；阈值：50；辅助加热区：260；离子源温度：230；四极杆温度：150。1.3.6 活性物质对柑桔炭疽菌的毒力测定参照1.3.3，配制活性物质浓度为40、20、10、5、2.5、1.25ug/mL的带药培养基进行室内毒力测定。使用DPS软件计算毒力回归方程、有效中浓度(EC50)及相关系数。1.3.7 活性物质对菌丝生长的影响参照1.3.3，配制质量浓度为20ug /mL带药培养基，培养对照菌丝和处理菌丝120h后，各挑取少许对照和处理菌落边缘菌丝，制成玻片，显微镜下观察菌丝的差异。2 结果与分析2.1 独活乙醇提取物对三种病原菌的毒力测定按照1.3.2对独活进行超声波粗提取，其提取率为10.5%。从表1可以看出，独活乙醇粗提取物对3种供试真菌均有很好的抑制作用，推测独活中含有抑菌活性较高的物质。独活提取物对柑桔炭疽菌的抑制效果最好，EC50为0.289mg/mL，因此采用柑桔炭疽菌作为下一步活性跟踪的指示菌。表1 独活乙醇提取物对柑桔3种病原菌的毒力Table1 Antifungal virulence of Radix Angelicae Biseratae ethanol extracts against three citrus Pathogens病原菌Citrus pathogen抑制中浓度EC50(mg/mL)毒力回归方程Linar regression equation相关系数Correlationc oeffcientP.digitatum0.5403y=5.3451+1.2967x0.9968P.italicum0.4567y=5.4755+1.3971x0.9956C.gloeosporioides0.289y=6.0999+2.0404x0.96832.2 活性成分的别离及离体生测参照1.3.4中方法，将2.1 g独活乙醇提取物进行初步溶剂萃取别离，别离出A、B、C、D、E五个组分，各组分回收质量分别为0.2137 g、0.6725 g、0.1923 g、0.6482 g和0.2781 g，各组分抑菌效果如表2所示。B组分提取率较高，且对柑桔炭疽菌的抑制率达95.38 %，抑制率明显高于其它组分。表2 AE各组分对柑桔炭疽菌的抑制效果Table 2 Inhibition effect of compounds AE on hyphae of C.gloeosporioides组分compoundABCDE提取率%Extract rate10.1832.029.1830.8713.24抑制率%Inhibitory rate36.87 95.3830.72 25.33 37.65 参照1.3.4中的方法，对B组分进行系统的柱层析别离，别离出16个组分，如表3所示，发现B2组分对柑桔炭疽菌的抑制效果最正确，抑制率为83.15%。表3 B1B6各组分对柑桔炭疽菌的抑制效果Table 3 Inhibition effect of compounds B1B6 on hyphae of C.gloeosporioides 组分 compoundB1B2B3B4B5B6提取率%Extract rate15.4824.6918.7216.8313.547.21抑制率%Inhibitory rate14.6983.1566.332.6848.926.792.3 活性物质的结构鉴定通过GC-MS分析鉴定B2组分，其中主要含有异佛手柑内酯Isobergapten、牛防风素Sphondin、茴芹内酯Pimpinellin、异茴芹内酯Isopimpinellin4种物质，均属香豆素类化合物。表4 B2组分GC-MS分析Table 4 Analysis of GC-MS of component of B2峰号Peak No.化合物名称Compound Name分子式Formula分子量Molecular Weight保存时间(min)Retention time置信度(%)Confidence1佛手柑内酯 IsobergaptenC12H8O421648.55086.72牛防风素 SphondinC12H8O421649.49389.23茴芹内酯 PimpinellinC13H10O524651.60290.44异茴芹内酯 IsopimpinellinC13H10O524654.72790.6图1 B2组分气相色谱图Fig.1 The gas chromatograph map of B2 component1 2 3 4图2 14号峰物质的结构Fig.2 The chemical structure of the material of 14 peaks2.4 B2组分中3种化合物对柑桔炭疽菌的抑制作用由表5可知B2组分中异佛手柑内酯、茴芹内酯、异茴芹内酯3种化合物对柑桔炭疽菌均有抑制作用，其中茴芹内酯的抑菌活性最好，其EC50为41.5216 ug/mL。说明香豆素类化合物具有较好的抑菌活性，具有开发为杀菌剂先导化合物的潜能。表5 3种化合物对柑桔炭疽菌的毒力Table 5 The toxicity of three compounds against C.gloeosporioides化合物名称Compound Name抑制中浓度EC50(ug/ml)毒力回归方程Linar regression equation相关系数Correlationc oeffcient异佛手柑内酯Isobergapten46.5687Y=3.1397+1.1276*X0.9881茴芹内酯Pimpinellin41.5216Y=2.7415+1.3956*X0.9842异茴芹内酯Isopimpinellin45.5681Y=3.2954+1.0277*X0.97802.5 茴芹内酯对柑桔炭疽菌菌丝的影响图3 20g/mL茴芹内酯处理120 h后的柑桔炭疽菌菌丝体(a)、分生孢子(b)和对照菌丝体(c)、分生孢子(d)Fig. 3 Mycelium(a)、conidium (b) of C.gloeosporioides treated with Pimpinellin in 20g/mL for 120h and normalmycelium(c)、normalconidium(d)of C.gloeosporioides观察20ug/mL茴芹内酯处理120h后柑桔炭疽菌的菌丝形态发现，经茴芹内酯处理过的炭疽菌菌丝隔膜消失或隔间距分布不均匀，菌丝畸形，分支增多，两侧菌丝壁粗糙 ，局部分生孢子内油球消失。 3讨论柑桔是世界上第一大水果，其贮藏运输过程中因受侵染性病害的影响极易造成果实腐烂8。目前化学合成的保鲜剂如25%咪鲜胺乳油9虽然能够到达防腐保鲜的目的，但是长期大量使用对人体健康不利，可能出现致癌、致畸、致突变等情况，而且还会引起农药残留等环境问题。因此从植物中寻找抑菌活性物质成为杀菌剂研究领域的一个热点。本研究说明，独活乙醇提取物对3种供试柑桔病原真菌均有较好的抑制效果。通过溶剂萃取、柱色谱别离、GC-MS等一系列方法别离鉴定得到活性组分B2中含有异佛手柑手酯、茴芹内酯、异茴芹内酯、牛防风素4种香豆素化合物，测定了前三种化合物对柑桔炭疽菌的毒力，结果说明三者对柑桔炭疽菌有显著的抑制作用，其中茴芹内酯的抑制活性最好，其EC50为41.5216ug/mL。香豆素类化合物具有如抗菌杀虫、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘等多方面的生物学活性10，是香料、化装品、农药、医药等方面的重要原料。刘丽梅等11发现秦皮素、秦皮乙素、秦皮甲素、秦皮苷和6，7-二甲氧基-8-羟基香豆素5种香豆素单体对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌等9种细菌均有明显抑菌作用。石志琦等12发现天然化合物蛇床子素对草坪纹枯病菌、芒果炭疽病菌、苹果叶枯病菌、辣椒疫霉病菌等13种植物病原菌有不同的抑制活性，对大多数病菌抑制中浓度在21.15 61.62 ug/mL之间。因此，以香豆素类化合物为先导化合物合成高效抑菌化合物，开发出绿色、环保、高效的植物源杀菌剂具有很好的开展前景。独活资源丰富13，应用广泛，其主要成分为香豆素类，其次为挥发油类、有机酸、糖类等14。李荣芷等15从独活中别离出二氢欧山芹醇，二氢欧山芹素，甲氧基欧芹素，异欧前胡素等8种香豆素化合物。kawai等 16从白亮独活的地上局部别离到具有抗菌作用的-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid和11个以甲酯形式得到的齐墩果烷型三萜皂苷。因此，将独活作为杀菌植物进行开发是可行的。参考文献 References:1LAN Guang-Sheng, Occurrence and control of citrus Storage diseases. 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