生物化学实验课件资料讲解.ppt

生物化学实验课件实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：实验室规则及安全、卫生教育实验室规则及安全、卫生教育1 1、每次实验前必须详细预习实验讲义，明确实、每次实验前必须详细预习实验讲义，明确实验原理及操作步骤，并在记录本上拟出操作时的注验原理及操作步骤，并在记录本上拟出操作时的注意事项。意事项。2 2、实验时自觉遵守课堂纪律，严格按操作规程、实验时自觉遵守课堂纪律，严格按操作规程操作，既要独立操作又要与其他同学配合。操作，既要独立操作又要与其他同学配合。3 3、实验时应严格按照实验步骤及试剂用量进行、实验时应严格按照实验步骤及试剂用量进行操作，不能任意变更。不熟悉的仪器和设备，应先操作，不能任意变更。不熟悉的仪器和设备，应先请老师讲解后使用，切勿随意乱动。请老师讲解后使用，切勿随意乱动。4 4、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成作原始记录的良好习惯。作原始记录的良好习惯。作原始记录的良好习惯。作原始记录的良好习惯。5 5、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问题的办法。题的办法。题的办法。题的办法。6 6、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后方可补领，并按规定赔偿。方可补领，并按规定赔偿。方可补领，并按规定赔偿。方可补领，并按规定赔偿。7、精密贵重仪器每次使用后应登记姓名并记录仪器使用情况。要随时保持仪器的清洁。如发生故障，应立即停止使用并报告指导教师。8、验中所用得玻璃仪器及其它器皿，应洗涤干净，桌面、地面要保持清洁有序，实验完毕后，所用仪器设备应恢复原状。9、必须遵守实验室规则：、必须遵守实验室规则：（1）室内不得高声谈笑，保持安静的实验环境。）室内不得高声谈笑，保持安静的实验环境。（2）爱护仪器，不得浪费药品，节省水电，遵守学生守则）爱护仪器，不得浪费药品，节省水电，遵守学生守则及实验室安全、卫生等制度。及实验室安全、卫生等制度。（3）公用仪器及试剂瓶用完后应及不要移动原有的位置。）公用仪器及试剂瓶用完后应及不要移动原有的位置。注意瓶塞切勿盖错，以免污染试剂，用毕后立即放回原处。对注意瓶塞切勿盖错，以免污染试剂，用毕后立即放回原处。对于有害药品，应按实验室规定取用。于有害药品，应按实验室规定取用。（4）滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废品袋，切勿丢入水）滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废品袋，切勿丢入水池，以保证下水道畅通。池，以保证下水道畅通。（5）如用仪器有损坏，立即向指导老师报告，再行登记。）如用仪器有损坏，立即向指导老师报告，再行登记。（6）保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，）保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，如书包等要放在实验室指定地方，不得乱放在实验桌上。如书包等要放在实验室指定地方，不得乱放在实验桌上。（7）由学生轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、）由学生轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和服务性的工作，特别注意打扫水槽中废弃物。安全和服务性的工作，特别注意打扫水槽中废弃物。（8）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、窗是否关闭，以保证实验室安全。窗是否关闭，以保证实验室安全。（9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。实验一实验一 糖类的性质实验糖类的性质实验糖类的重要鉴别方法是糖类的重要鉴别方法是 反应和反应和反应。糖类、苷类及其他含糖物质与反应。糖类、苷类及其他含糖物质与 萘酚和萘酚和浓硫酸呈紫红色的环的反应称为浓硫酸呈紫红色的环的反应称为 反应，该反应反应，该反应可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和盐酸能产生红色的反应称为盐酸能产生红色的反应称为反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖的反应速度要慢得多。的反应速度要慢得多。非还原性糖在酸存在下，加热水解后产生还原性非还原性糖在酸存在下，加热水解后产生还原性的单糖。淀粉的水解是逐步发生的，先水解成紫糊的单糖。淀粉的水解是逐步发生的，先水解成紫糊精，再水解成红糊精、无色糊精、麦芽糖，最终水精，再水解成红糊精、无色糊精、麦芽糖，最终水解成葡萄糖。用碘液可以检查这种水解过程。完全解成葡萄糖。用碘液可以检查这种水解过程。完全水解后，可用试剂加以证实。水解后，可用试剂加以证实。多糖类遇浓硫酸被水解成单糖，单糖被浓硫酸脱多糖类遇浓硫酸被水解成单糖，单糖被浓硫酸脱水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与 萘萘酚发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩合物。酚发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩合物。一、实验目的：一、实验目的：1、了解糖类某些颜色反应的原理；、了解糖类某些颜色反应的原理；2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法；、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法；3、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及 其原理。其原理。二、实验原理二、实验原理(一一)颜色反应颜色反应1.-1.-萘酚反应萘酚反应萘酚反应萘酚反应糖在浓无机酸糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）（硫酸或盐酸）（硫酸或盐酸）（硫酸或盐酸）作用下，脱水生作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色萘酚生成紫红色物质。物质。注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，不是糖类的特异反应。不是糖类的特异反应。不是糖类的特异反应。不是糖类的特异反应。OCHO-CH2OH2.间苯二酚反应间苯二酚反应在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。(二二)还原作用还原作用许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。量测定。量测定。量测定。本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是CuCu2 2的碱的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）的的CuCu2OO沉淀。沉淀。本尼迪克特试剂是改良的斐林试剂。（见P100,101脚注）三、器材及试剂三、器材及试剂1 1、器材：、器材：、器材：、器材：试管、试管架、滴管、水浴锅（或电炉）试管、试管架、滴管、水浴锅（或电炉）2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：1%1%葡萄糖溶液，葡萄糖溶液，1%1%果糖溶液，果糖溶液，1%1%蔗糖溶液，蔗糖溶液，1%1%淀粉，淀粉，1%1%麦芽糖溶液，麦芽糖溶液，0.1%0.1%糠醛溶液，糠醛溶液，浓硫酸，浓硫酸，莫氏试剂，莫氏试剂，塞氏试剂，塞氏试剂，斐林试剂，斐林试剂，本尼迪克特试剂本尼迪克特试剂四、实验步骤四、实验步骤 1 1、-萘酚反应萘酚反应萘酚反应萘酚反应1%1%葡萄溶液葡萄溶液葡萄溶液葡萄溶液1%1%果糖溶液果糖溶液果糖溶液果糖溶液各加各加1ml1ml 各加各加各加各加2 2滴滴滴滴 各加各加各加各加1ml1ml 1%1%蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液莫氏试剂莫氏试剂莫氏试剂莫氏试剂 浓硫酸浓硫酸浓硫酸浓硫酸1%1%淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液 0.1%0.1%糠醛溶液糠醛溶液糠醛溶液糠醛溶液 5支支试试管管混混匀匀观观察察记记录录各各管管颜颜色色Molisch反应（反应（-萘酚反应萘酚反应）浓浓H2SO4界面：显色界面：显色-鉴定：所有的糖类均可显色鉴定：所有的糖类均可显色 2.间苯二酚反应间苯二酚反应 1%1%葡萄糖溶液葡萄糖溶液葡萄糖溶液葡萄糖溶液 各加各加各加各加0.5ml0.5ml 各加各加各加各加5ml5ml 1%1%果糖溶液果糖溶液果糖溶液果糖溶液 赛氏试剂赛氏试剂赛氏试剂赛氏试剂 1%1%蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液 3支支试试管管混混 均均同同 时时置置 沸沸水水 浴浴中中观观 察察记记 录录各各 管管颜色颜色3、糖与斐林试剂的反应、糖与斐林试剂的反应1 1）检验试剂：）检验试剂：）检验试剂：）检验试剂：1ml斐斐林试剂林试剂或或1ml本本尼尼迪迪克克特试剂特试剂4ml蒸蒸馏馏水水 1支支试试管管加加热热煮煮沸沸观观察察现现象象2）实验过程2ml2ml斐林试剂斐林试剂1%1%葡萄糖溶液葡萄糖溶液各加各加1ml1ml 1%1%果糖溶液果糖溶液 或或1%1%蔗糖溶液蔗糖溶液1%1%麦芽糖溶液麦芽糖溶液 2ml2ml本尼迪克特本尼迪克特1%1%淀粉溶液淀粉溶液试剂试剂 5支支试试管管观观察察记记录录各各管管颜颜色色置置沸沸水水浴浴中中加加热热取取出出冷冷却却五、实验数据记录（五、实验数据记录（五、实验数据记录（五、实验数据记录（P99,10299,102）六、实验思考题：六、实验思考题：六、实验思考题：六、实验思考题：1.1.可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？2.-2.-萘酚反应的原理是什么？萘酚反应的原理是什么？3.3.斐林试剂、本尼迪克特试剂检验糖的斐林试剂、本尼迪克特试剂检验糖的原理是什么？原理是什么？七、预习：七、预习：七、预习：七、预习：P P109109实验二实验二实验二实验二实验二实验二 脂肪碘值的测定脂肪碘值的测定实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表1与表与表2：一、实验目的一、实验目的 1 1、学习和掌握测定脂肪碘值的原理和方法。、学习和掌握测定脂肪碘值的原理和方法。2 2、了解和学习、了解和学习空白对照实验空白对照实验的原理和方法的原理和方法教材第教材第6、7页页二、实验原理二、实验原理碘值（价）是指碘值（价）是指100g100g脂肪在一定条件下吸收碘的脂肪在一定条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用以判断克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用以判断脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。常用碘与脂肪中不饱和脂肪酸的双键起加成作用。脂肪的不饱和程度越高，所含的不饱和脂肪酸越多，与其双键起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不饱和度。I I I I2 2 2 2+CH=CHCHICHI 本实验用溴化碘(Hanus试剂)代替碘。用一定量(必须过量)溴化碘和待测的脂肪作用后，用硫代硫酸钠滴定的方法测定溴化碘的剩余量，然后计算出待测脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。加成作用：加成作用：IBr+CH=CHCHICHBr 剩余溴化碘中碘的释放：剩余溴化碘中碘的释放：IBr+KI KBr +I2再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘：再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘：I2+2Na2S2O3 2Na2S4O6+2NaI三、器材及试剂三、器材及试剂1 1、器材、器材：碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平2 2、试剂：、试剂：花生油，花生油，花生油，花生油，HanusHanusHanusHanus试剂试剂试剂试剂,四氯化碳，四氯化碳，四氯化碳，四氯化碳，10%10%10%10%碘化钾溶液碘化钾溶液碘化钾溶液碘化钾溶液 0.05%mol/L 0.05%mol/L 0.05%mol/L 0.05%mol/L 硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠溶液，1%1%1%1%淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液四、实验步骤四、实验步骤0.3-0.4g0.3-0.4g油两份油两份 洁净碘瓶洁净碘瓶 加入加入10ml10ml四氯化碳四氯化碳 轻轻轻轻振动振动 加入加入HanusHanus试剂试剂25ml25ml塞好瓶塞，并在塞子与瓶口塞好瓶塞，并在塞子与瓶口间加入数滴间加入数滴KIKI溶液溶液 混匀混匀 置暗处置暗处3030分钟分钟 打开瓶塞，打开瓶塞，将将KIKI流入瓶内流入瓶内 加入加入KI 10mlKI 10ml和蒸馏水和蒸馏水50ml,50ml,将瓶塞和瓶颈将瓶塞和瓶颈上的液体冲入瓶内上的液体冲入瓶内 混匀混匀 用用0.1ml/L0.1ml/L的的NaNa2 2S S2 2O O3 3滴定至淡黄滴定至淡黄色色 加入加入1%1%淀粉溶液约淀粉溶液约1ml1ml继续滴定继续滴定 至接近滴定终点至接近滴定终点(蓝色极蓝色极淡淡)加塞用力振荡加塞用力振荡 再滴至滴定终点（水层与非水层全部都无再滴至滴定终点（水层与非水层全部都无色）色）另外再做一份空白实验。另外再做一份空白实验。(除不加样品外，其它操作同样品除不加样品外，其它操作同样品实验。实验。)附附 注注（1 1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应不完全。应不完全。（2 2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加试剂不够，必须再添加101015mL15mL试剂。试剂。（3 3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CClCCl4 4中中溶解不完全，可再加些溶解不完全，可再加些CClCCl4 4。（。（4 4）将近滴定终点时，用力）将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡不够，如震荡不够，CClCCl4 4展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使碘进入水层。碘进入水层。（5 5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。五、实验结果记录五、实验结果记录 1 1 1 1、原始数据记录、原始数据记录、原始数据记录、原始数据记录 1 1 1 1）花生油的质量）花生油的质量）花生油的质量）花生油的质量 W W W W值值值值 2 2 2 2）NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3摩尔浓度摩尔浓度摩尔浓度摩尔浓度 C C C C值值值值2 2）滴定结果记录：）滴定结果记录：A A A A为滴定空白所消耗的为滴定空白所消耗的为滴定空白所消耗的为滴定空白所消耗的NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3溶液溶液溶液溶液mLmLmLmL数；数；数；数；B B B B为滴定样品所消耗的为滴定样品所消耗的为滴定样品所消耗的为滴定样品所消耗的NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3溶液溶液溶液溶液mLmLmLmL数；数；数；数；c c c c为为为为NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3溶液的摩尔浓度。溶液的摩尔浓度。溶液的摩尔浓度。溶液的摩尔浓度。最后求出平均碘值。最后求出平均碘值。最后求出平均碘值。最后求出平均碘值。六、思考题：六、思考题：1 1 1 1、何谓碘值？具有什么意义？、何谓碘值？具有什么意义？、何谓碘值？具有什么意义？、何谓碘值？具有什么意义？2 2 2 2、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？七、预习：七、预习：P122 实验三 氨基酸的分离鉴定-纸层析法一、层析技术简介层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。二、层析的分类1、按分离相状态分类：根据层析过程中的固定相和流动相进行分类，大致可以分以下几类：（1）气相层析是以气体为流动相的层析方法，称之为气相层析。根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液层析(GLC)。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质，后者是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质。（2）液相层析是以液体为流动相的层析方法，称之为液相层析。同理，根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固层析(LSC)和液-液层析(LLC)。液相层析的固定相性质与气相层析相近。（3）超临界层析是以流体为流动相的层析方式，称为超临界层析(SFC)。它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的，这种分离方法更具专一性。2、按层析的分离机理分类（1）排阻层析利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。（2）离子交换层析利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。（3）吸附层析利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。（4 4）分配层析）分配层析被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。（5）亲和层析在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。（6）金属螯合层析利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。（7）疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。（8）反向层析利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法，称之为反相层析。（9）聚焦层析利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。（10）灌注层析利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称之为灌注层析。实验三实验三 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定-纸层析法纸层析法氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定-纸层析法纸层析法一、实验目的一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法二、实验原理二、实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。法。(其原理参见其原理参见其原理参见其原理参见P P P P33333333)层析溶剂由有机溶剂层析溶剂由有机溶剂(或称有机相，是流动的、或称有机相，是流动的、或称有机相，是流动的、或称有机相，是流动的、被水饱和的，构成流动相被水饱和的，构成流动相被水饱和的，构成流动相被水饱和的，构成流动相)和水和水(通常是被结合在滤通常是被结合在滤通常是被结合在滤通常是被结合在滤纸上，构成固定相纸上，构成固定相纸上，构成固定相纸上，构成固定相)组成。组成。(P(P(P(P34343434纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间纤维之间纤维之间纤维之间纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易扩散，并能与跟水混合的溶剂扩散，并能与跟水混合的溶剂(有机相有机相)形成类似不相混形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的：原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离 R Rf f 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量、展层方式、层析温度和pH等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材及试剂三、器材及试剂1、器材：器材：器材：器材：层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾器，电吹风，培养皿，层析滤纸器，电吹风，培养皿，层析滤纸(质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。新华1号或3号滤纸(或Whatman 1号或3号滤纸)2、试剂：试剂：试剂：试剂：0.5%0.5%的赖氨酸，的赖氨酸，0.5%0.5%的脯氨酸，的脯氨酸，0.5%0.5%的缬氨酸，的缬氨酸，0.5%0.5%的苯丙氨酸，的苯丙氨酸，0.5%0.5%的混合的混合氨基氨基.酸，显色剂，扩展剂酸，显色剂，扩展剂四、实验步骤四、实验步骤1 1取扩展剂约取扩展剂约5ml5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，置于小烧杯中做平衡溶剂，然后将小烧杯置于密闭的层析缸中（或标本缸）。然后将小烧杯置于密闭的层析缸中（或标本缸）。2 2取层析滤纸（长取层析滤纸（长22cm22cm，宽，宽14cm14cm）一张。）一张。在纸的一端距边缘在纸的一端距边缘2-3cm2-3cm处用铅笔划一条直线，在处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔此直线上每间隔2cm2cm作一个记号作一个记号(“”(“”型而不是型而不是型而不是型而不是“.”“.”型型型型)，共作，共作5 5个记号作为点样点；另外，沿展层个记号作为点样点；另外，沿展层方向在滤纸两边距边缘约方向在滤纸两边距边缘约0.5-1cm0.5-1cm处对称地划两条处对称地划两条直线，分别将其四等分，各取其三个等分点作为缝直线，分别将其四等分，各取其三个等分点作为缝线点。线点。3 3、点样、点样、点样、点样 用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这6 6个点样点个点样点位置上位置上(注意速度要快，否则易扩散开注意速度要快，否则易扩散开)，干后再点一次。每，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过点在纸上扩散的直径最大不超过3mm3mm。4 4扩展扩展扩展扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触，将盛用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触，将盛有约有约20ml20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需要低于点样纸的液面需要低于点样纸1cm1cm）。待溶剂上升）。待溶剂上升15-15-20cm20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或者用吹风机吹干。干燥或者用吹风机吹干。5 5显色显色 用喷雾器均匀喷上用喷雾器均匀喷上0.1%0.1%茚三酮正丁醇茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤溶液，然后置烘箱中烘烤5 5分钟（分钟（100100）或用热风）或用热风吹干即可以显出个层析斑点。吹干即可以显出个层析斑点。6 6计算各种氨基酸的计算各种氨基酸的RfRf值值五、实验结果记录五、实验结果记录六、思考题：六、思考题：1 1何谓纸层析法？何谓纸层析法？2 2何谓何谓R Rf f值？影响值？影响R Rf f值的主要因素是什么？值的主要因素是什么？3 3怎样制备扩展剂？怎样制备扩展剂？预习：实验四预习：实验四 蛋白质及氨基酸的呈色反应。蛋白质及氨基酸的呈色反应。P P125125实实 验验 四四 蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的一、实验目的1 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3 3学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理二、实验原理（一）双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应:尿素加热至尿素加热至180180左右，生成双缩脲并左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与CuCu2+2+结合生成结合生成紫红色化合物。紫红色化合物。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。注意注意:双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能发生此反应发生此反应 如如 CS-NH CS-NH2 2，-CH-CH2 2-NH-NH2 2，O=C C=O O=C C=O 等。等。NH NH2 2 NH NH2 2NHNH3 3也干扰此反应，因为也干扰此反应，因为NHNH3 3与与CuCu2+2+可生成暗蓝色可生成暗蓝色的络离子的络离子(Cu(NH(Cu(NH3 3)4 42+2+，四氨合铜，四氨合铜)。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。（二）茚三酮反应除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应(尿素、马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。)因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定是蛋白质或氨基酸。在定性定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。(此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。)（三）黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。一步形成深橙色的硝醌酸钠。(多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反应非常灵敏。应非常灵敏。)（四）考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。(它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2分钟达到平衡，在室温1小时内稳定，常用来定量测定蛋白质含量)三、器材及试剂三、器材及试剂1 1 1 1、器材：、器材：、器材：、器材：电炉、试管、试管架、吸管、吸管架等电炉、试管、试管架、吸管、吸管架等2 2 2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：尿素尿素,1%CuSO,1%CuSO4 4溶液，溶液，10%NaOH 10%NaOH溶液溶液2%2%卵清蛋白溶液，卵清蛋白溶液，0.5%0.5%甘氨酸溶液，甘氨酸溶液，0.1%0.1%茚三茚三酮水溶液，酮水溶液，0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，0.5%0.5%苯酚溶液，苯酚溶液，浓硝酸，浓硝酸，0.3%0.3%色氨酸色氨酸0.3%0.3%酪氨酸溶液，考马斯亮蓝酪氨酸溶液，考马斯亮蓝染液。染液。四、实验步骤四、实验步骤双缩脲反应取少量尿素结晶于干燥试管中取少量尿素结晶于干燥试管中 微火加热熔微火加热熔化化 硬化时停止加热硬化时停止加热 冷后，加冷后，加10%NaOH10%NaOH溶液溶液约约1ml 1ml 振荡混匀振荡混匀 加一滴加一滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液溶液 再振荡再振荡 观察记录观察记录另取一只试管另取一只试管 加卵清蛋白溶液约加卵清蛋白溶液约1ml 1ml 和和10%NaOH10%NaOH溶液约溶液约2ml 2ml 摇匀摇匀 加加1%CuSO1%CuSO4 4溶液溶液2 2滴滴 随加随摇随加随摇 观察记录观察记录 茚三酮反应(1)(1)取两支试管取两支试管 分别加入蛋白质溶液和甘氨分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各酸溶液各1ml 1ml 再各加再各加0.1%0.1%茚三酮水溶液茚三酮水溶液0.5ml 0.5ml 混匀混匀 沸水浴中加热沸水浴中加热1 12 2分钟分钟 观察观察(2)(2)在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液甘氨酸溶液 风干风干 在原处滴一滴在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液茚三酮乙醇溶液 微火旁烘干显色微火旁烘干显色 观察观察 黄色反应向向6 6支试管中分别按下表加入试剂，观察各试管支试管中分别按下表加入试剂，观察各试管出现的现象，待各管出现黄色后，与室温下逐滴加入出现的现象，待各管出现黄色后，与室温下逐滴加入 10%NaOH10%NaOH溶液至碱性，观察颜色变化。溶液至碱性，观察颜色变化。考马斯亮蓝反应 取取2 2支试管，按下表操作：支试管，按下表操作：五、实验结果记录五、实验结果记录 见见P P131-132131-132表表六、思考题：六、思考题：通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什么？的方法？它们的原理是什么？七、预习：七、预习：P133P133实验五实验五 蛋白质等电点测定和蛋白质等电点测定和沉淀反应沉淀反应实验五实验五 蛋白质的等电点测定和沉淀反应蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、实验目的一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质；、了解蛋白质的两性解离性质；2、学习测定蛋白质等电点的方法；、学习测定蛋白质等电点的方法；3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义；、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义；5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。、了解蛋白质变性与沉淀的关系。二、实验原理二、实验原理二、实验原理二、实验原理(一一)蛋白质的等电点的测定蛋白质的等电点的测定蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡(见见P133图图)。COOHCOOH P P (蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子)NH NH2 2 COO-COO-COOH COO-COO-COOH P P P P