幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒的生产(胶体金法)-幽门螺杆菌怎么引起的.docx
幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒的生产(胶体金法):幽门螺杆菌怎么引起的 摘 要 目的:建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒(胶体金法)。方法:以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。结果:用柠檬酸还原法制备的胶体金溶液呈亮红色,以此试纸条检测临床血清标本。受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法中出现1条红色(比照)沉淀线,为血清学诊断阴性;出现2条红色(样品和比照)沉淀线,为血清学诊断阳性。 关键词 幽门螺杆菌 胶体金 doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.02.146 材料与方法 试验材料:幽门螺杆菌菌种、氯金酸、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白、聚乙二醇,以上试剂均为分析纯。厌氧培育罐AnaeroPack Rectangular Jar。 试验方法:玻璃器皿的清洁:制备胶体金的所用容器均应反复清洗,并硅化处理玻璃容器的内表面,最终用MQ超纯水冲洗晾干备用。胶体金颗粒的制备:取2%氯金酸溶液5ml,加1000ml超纯水,加热沸腾后,取1%柠檬酸三钠17.5ml一次性快速加入煮沸的氯金酸溶液中,接着加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色,颜色稳定后接着加热3分钟,室温冷却,补充失水至原体积。免疫胶体金复合物的制备:目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例,用0.1mol/L的碳酸钾溶液调整胶体金溶液的pH至5.96.2,取5个干净锥形瓶分装胶体金溶液。将待标记蛋白质逐级稀释后(由210g另设比照管),各取等体积依次加入一系列装有胶体金的锥形瓶中,混匀;胶体金复合物的纯化:超速离心法纯化免疫胶体金复合物。先以15000rpm离心60分(4),弃上清,用保存液悬起较疏松的红色沉积物;即为初步纯化的免疫胶体金复合物。胶体金标记蛋白质的检定:以保存液作比照测530nm处OD值,4避光保存。金标垫的制备:纯化的胶体金不同程度稀释后,运用划膜仪匀称喷于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。保存液稀释胶体金标记SPA复合物原液至工作浓度,按比例匀称浸于玻璃纤维素膜,-20冻存,冷冻真空干燥后,密封保存。全菌超声粉碎抗原的制备1:幽门螺杆菌采纳固体斜培育基微需氧(5%O2、10%CO2、85%N2)37培育,72小时收集菌体。H.pylori菌体用小体积pbs悬浮,冰浴条件下超声粉碎频率8090Hz次数为350,超声粉碎呈匀称细颗粒状;4,15000r/分,离心60分,收集上清;上清测蛋白浓度后分装,于-4保存。H.pylori配体固相硝酸纤维素膜的制备:H.pylor抗原室温溶化后,15000r/分,离心10分,取上清2mg/ml用划膜仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的视察结果的测试反应区,定义为检测带(T),距离检测带5mm远的质控带(C)用dispenser线形包被正常兔IgG(2mg/ml)。37干燥2小时,4密封保存。样品垫的处理:选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后匀称浸于玻璃纤维素膜,室温干燥备用。试纸条组装:依据功能不同可将试纸条分为四个部分:上段为手持部位(吸水滤纸:汲取检测样品中多余液体),中段为试验反应区(硝酸纤维素膜:包括判读结果的检测带T和指示试纸条质量的质控带C),下段为样品区(玻璃纤维素膜:接触待检测样品),在中下段之间(C区)放置浸有胶体金标记复合物的金标垫;而整个试纸条贴附于双面胶白色塑料背板。 临床血清标本H.pylor抗体IgG检测:取消化门诊就诊的临床血清加于试纸条样品区,15分左右起先视察结果,20分视察终止。 结 果 胶体金颗粒制备:我们试验所用柠檬酸还原法制备的胶体金溶液呈亮红色,金颗粒大小基本一样,分布匀称,圆形。 胶体金标记复合物的制备与纯化:将胶体金溶液pH值调至8.0,200ml胶体金溶液在磁力搅拌下缓缓加入尿素酶(2mg/ml),加入牛血清白蛋白增加胶体金溶液的稳定性,金颗粒表面会吸附有牛血清白蛋白。 临床血清标本H.pylor抗体IgG检测结果:受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法中出现1条红色(比照)沉淀线,为血清学诊断阴性;出现2条红色(样品和比照)沉淀线,为血清学诊断阳性。 讨 论 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术,现在已胜利用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。 标记好的免疫胶体金纯化处理的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。依据胶体金颗粒大小不同和所标记蛋白质的特性不同,选择并调整离心转速和离心时间可以达到一般的纯化目的。如有须要可将上述初步纯化免疫胶体金用10%30%蔗糖或甘油溶液做密度梯度离心或用凝胶过滤法进一步纯化。 参考文献 1 陈敏章,胡伏莲,周殿元,等.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京:中国科学技术出版社,1997:322.
