灭活的青春双歧杆菌治疗小鼠肠源性感染的血清学分析-双歧杆菌三联活菌胶囊.docx

灭活的青春双歧杆菌治疗小鼠肠源性感染的血清学分析|双歧杆菌三联活菌胶囊 R371 A 16723783(2011)05004402 目的 视察灭活的双歧杆菌对菌群失调及免疫功能低下致小鼠肠源性感染的治疗作用。方法 70只昆明种小鼠随机分为7组，除正常比照组，菌群失调小鼠与免疫功能低下小鼠两种动物模型各设活菌组、死菌组、自然复原组，每组10只，灌胃治疗后检测临床血清学指标。结果 活菌组、死菌组同自然复原组相比，临床血清学指标复原至正常比照组水平。结论 双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌悬液相同的治疗小鼠肠源性感染作用。 双歧杆菌 肠源性感染 血清学 Serology analysis on heat-killed Bifidobacterium adolescentis curing enterogenic infection in mice SUN Jie1, LUO Yuan2, QIAO Dan2, WANG Min2, MA Xiao-Wan2, LUN Yong-Zhi2 Objective To observe the curing effect of heat-killed bifidobacterium to mice with enterogenic infection caused by dysbacteriosis and immunocom promise. Methods A total of 70 mice were randomly divided into 7 groups. The animal models of dysbacteria mice and immunocom promise mice set up living bacterium group, heat-killed bacterium group, spontaneous recovery group respectively, and normal control group (10 of each). After intragastric administration therapy, the serum indexes were detected. Results Versus spontaneous recovery group, all indexes of live strains group and heat-killed strains group recuperated to normal control level. Conclusion The heat-killed bifidobactera are effective in the treatment of enterogenic infection in mice, and the effect is the same as that of the living bifidobactera. Bifidobacterium；Enterogenic infection；Serology 肠源性感染即肠道中致病菌或条件致病菌通过肠黏膜侵入血循环和/或其它脏器引发的感染。目前肠源性感染已成为医院内感染的主要来源，其病死率超过30%1。正常状况下，包括双歧杆菌、乳杆菌在内的正常菌群黏附于肠黏膜，形成空间位阻，反抗外来菌的入侵。目前已有双歧杆菌制剂研制胜利并投放市场，成为防治肠源性感染的首选药物。但国内外开发的制剂均是活菌，其有效期不过一年，这使其应用范围与条件受到很大的限制。已有探讨表明灭活的双歧杆菌制剂可能具有与活菌相同的防治肠源性感染的功效2。 本文通过检测试验小鼠的临床血清学指标，初步探讨了灭活的双歧杆菌对菌群失调与免疫功能低下致小鼠肠源性感染的治疗作用，为进一步研制双歧杆菌灭活制剂打下扎实基础。 材料与方法 一 材料 1 菌株：双歧杆菌DM8504菌株引自大连医科高校微生态学探讨所，经中国科学院微生物探讨所鉴定，该菌株为青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）。 2 试验动物：健康昆明种小鼠70只，雌雄各半，鼠龄6-8周龄，体重为20±2g，购自大连高校试验动物中心。 二 方法 1 双歧杆菌菌悬液的制备2：将双歧杆菌接种至BS肉汤培育基中，37厌氧培育48h，菌悬液4000r/min离心10min，分别得到SCS。用生理盐水（Normal Sodium，NS）重悬细菌，所得菌悬液分为活菌组和死菌组。其中死菌组水浴灭活处理（经BS肉汤检菌，证明灭活菌存在，并且仍保持正常细菌形态）。将活、死两组菌悬液用NS洗3次，离心弃上清，SCS重悬活、死双歧杆菌沉淀，使菌悬液浓度均达到1×1011 CFU/mL。 2 试验动物分组与造模：将昆明种试验小鼠随机分为10组，详细分组见表1。用9g/L NS配制成浓度为200g/L青霉素（大连美罗药业股份有限公司生产，100万单位青霉素钠/1.0g/瓶）溶液，3组小鼠进行青霉素液腹腔注射，0.2ml/只/d，连续3d，造成菌群失调动物模型。用9g/L NS配制成浓度为5mg/mL环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司）溶液，3组小鼠进行环磷酰胺液腹腔注射，0.3mL/只/d，连续3d，造成免疫功能低下动物模型。从第4d起先，活菌组采纳双歧杆菌活菌悬液灌胃；死菌组采纳双歧杆菌灭活菌悬液灌胃；自然复原组小鼠采纳NS灌胃，均为0.4ml/只/d，连续3d。 3 临床血清学指标检测：试验小鼠分别摘眼球采血处死，利用日本Olypus-AU400全自动生化仪对-谷氨酰氨转肽酶（GGT）、血清尿素氮（BUN）、乳酸脱氢酶（LDH）和血肌酐（CRE）进行测定全部数据经SPSS 12.0统计软件进行两独立样本的t检验分析 结果 试验组小鼠经双歧杆菌活菌悬液、灭活菌悬液以及NS灌胃治疗后，检测包括正常比照组小鼠在内的临床血清学指标，见表2。菌群失调小鼠中的活菌组、死菌组各死亡1只，自然复原组死亡2只；免疫功能低下小鼠中的活菌组死亡2只，死菌组和自然复原组各死亡3只；正常比照组死亡1只小鼠。 两种试验小鼠中死菌组与活菌组、正常比照组比较，GGT、BUN无明显差异，LDH则明显下降；死菌组与自然复原组比较，GGT、BUN显著下降。死菌组与活菌组、正常比照组、自然复原组比较，CRE无明显差异，但双歧杆菌菌悬液治疗效果较明显，其中活菌组小鼠血清中CRE水平比死菌组小鼠更加接近正常值。 菌群失调试验小鼠中死菌组与自然复原组比较，LDH虽无明显差异，但死菌组小鼠血清中LDH水平比自然复原组小鼠接近正常值；而免疫功能低下试验小鼠中死菌组与自然复原组比较，LDH水平显著上升且接近正常值。 探讨 现已明确以双歧杆菌为主的专性厌氧菌定植于肠黏膜上皮，能阻挡条件致病菌（多为G-杆菌与球菌）对肠黏膜的黏附和定植，具备所谓的定植抗力，是防止细菌或（和）内毒素移位进而发生肠源性感染的重要因素4。临床上由于抗生素滥用、烧伤或创伤、应用免疫抑制剂等会引起肠道内条件致病菌过度繁殖、全身和肠道的黏膜屏障损伤及免疫功能障碍，从而导致肠道菌群失调，损害肠道益生菌的定植抗力，是致病菌和（或）内毒素横向经肠黏膜逸出肠腔并形成肠源性感染的重要诱因5-7。 目前认为双歧杆菌一方面通过代谢产生大量的乳酸和乙酸，降低肠道的pH及Eh值，改善局部微环境，促进肠菌群失调的复原1；另一方面移位进入血循环，从而激活单核巨噬细胞系统的吞噬和杀菌功能，并促进应激状态下肠黏膜损伤的修复，维护肠黏膜屏障结构和功能的完整性，从而削减肠道细菌和（或）内毒素移位；再者双歧杆菌干脆刺激肠道免疫系统诱生sIgA，特殊是其中的胃肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue，GALT），而sIgA可以有效地包被革兰氏阴性杆菌，封闭细菌表面与肠黏膜上皮细胞结合的特异性位点，使对机体有害的细菌代谢产物释放受抑，细菌对肠黏膜上皮侵袭力因而减弱，并对肠道条件致病菌干脆起杀菌作用，削减肠道细菌移位的数量1,3。 但活菌制剂普遍存在保藏及运输不易等缺点，而灭活的死菌制剂，具有细菌浓度稳定，不会随时间的延长而出现递减的可能；不会经肠道转移造成二度感染；没有抗药基因转移，不会出现增加病原菌抗药性的危急；不易受胃酸屏障的影响；可与抗生素合用等诸多优点。 探讨表明双歧杆菌无论是否灭活，均可黏附于肠黏膜上皮细胞，而且双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌相像的生态效应，因此对肠道生理菌群具有肯定的调整作用，并进而通过与其它厌氧菌一起占据肠黏膜表面，形成生物学屏障，阻挡病原菌及条件致病菌的定植和入侵，从而阻挡肠源性感染的发生2,8。 由于肠源性感染与血液和（或）脏器感染干脆相关，因此可以通过检测某些临床血清学指标的改变来监控其发生与发展，甚至预后。其中，BUN与GGT水平的增高分别与急慢性肾病和肝病相关，LDH水平干脆反映机体心肾功能，CRE水平的增高则表明发生严峻肾实质性损害。 从临床血清学检测结果可知，与正常比照组及自然复原组相比，通过对肠源性感染小鼠进行双歧杆菌死活菌悬液灌胃治疗，全部检测指标均有明显改善，除LDH水平外，其它指标均复原至正常水平。此外，通过双歧杆菌死活菌悬液两者之间的相互比较，可以发觉活菌组小鼠临床血清学指标复原状况优于死菌组小鼠，即活菌悬液的短期治疗效果仍旧优于灭活菌悬液，但除LDH水平外两者之间无显著性差异。动物试验证明了双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌悬液相同的抗菌群失调致小鼠肠源性感染作用，进而表明双歧杆菌灭活菌悬液具有与活菌相像的生理效应，一方面复原肠道生理菌群的生态平衡，爱护并修复肠道黏膜，另一方面促进肠道益生菌增殖，从而在防治肠源性感染中起到了良好的治疗效果，并在肯定程度上替代抗生素 参考文献 1 Liong MT. Safety of probiotics: translocation and infectionJ. Nutr Rev. 2008; 66(4):192-202. 2 伦永志, 黄敏, 袁杰利, 等. 灭活的青春双歧杆菌对人大肠癌细胞的粘附J. 微生物学通报, 2003;30(4):55-59. 3 Oboyle CJ, Macfie J, Mitchell CJ, et al. Microbiology of Bacterial Translocation in Humans. Gut 1998;42(1):29-35. 4 Alvarez-Olmos MI, Oberhelman RA. Probiotic agents and infectious diseases: a modern perspective on a traditional therapyJ. Clin Infect Dis 2001;32(11):1567-1576. 5 伦永志, 黄敏, 袁杰利, 等. 灭活双歧杆菌调整小鼠抗生素相关性菌群失调. 中国微生态学杂志,2002;14(1):8-9. 6 Servin AL. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogensJ. FEMS Microbiol Rev. 2004; 28(4):405-440. 7 Peng YZ, Yuan ZQ, Xiao GX. Effects of early enteral feeding on the prevention of enterogenic infection in severely burned patientsJ. Burns. 2001; 27(2):145-149. 8 Zhong SS, Zhang ZS, Wang JD, et al. Competitive inhibition of adherence of enterotoxigenic Escherichia coli, enteropathogenic Escherichia coli and Clostridium difficile to intestinal epithelial cell line Lovo by purified adhesin of Bifidobacterium adolescentis1027. World J Gastroenterol 2004;10(11):1630-1633. 作者单位： 116013 辽宁大连大连港医院 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文