优良菌种的选育.ppt

第七章第七章 优良菌种的选育优良菌种的选育理想的工业发酵菌种应符合以下要求：理想的工业发酵菌种应符合以下要求：遗传性状稳定；遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。v菌种选育菌种选育，就是利用微生物遗传变异的特性，采用各种手段，就是利用微生物遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的菌株，以改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的菌株，以稳定提高抗生素生产或得到新的抗生素产品。稳定提高抗生素生产或得到新的抗生素产品。v任何抗生素要不断提高生产水平，菌种选育是一重要手段，任何抗生素要不断提高生产水平，菌种选育是一重要手段，一些高产菌株在传代和保藏过程中，不可避免地会逐步发生一些高产菌株在传代和保藏过程中，不可避免地会逐步发生退化，这也需要通过菌种选育来复壮菌种退化，这也需要通过菌种选育来复壮菌种 v 菌种选育常用的方法有：菌种的自然选育、诱变育种、菌种菌种选育常用的方法有：菌种的自然选育、诱变育种、菌种的基因重组。的基因重组。第一节第一节 微生物的遗传和变异微生物的遗传和变异微微生生物物是是研研究究现现代代遗遗传传学学和和其其它它许许多多主主要要的的生生物物学基本理论问题中最热衷的学基本理论问题中最热衷的研究对象研究对象研究对象研究对象。对对微微生生物物遗遗传传规规律律的的深深入入研研究究，不不仅仅促促进进了了现现现现代代代代分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学和和生生生生物物物物工工工工程程程程学学学学的的发发展展，而而且且为为育育育育种种种种工工工工作作作作提提供供了了丰丰富富的的理理论论基基础础，促促使使育育种种工工作作从从不不自自觉觉到到自自觉觉、从从低低效效到到高高效效、从从随随机机到到定定向向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义研究微生物遗传学的意义一、遗传与变异的概念一、遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗遗传传(heredity)：亲亲代代生生物物的的性性状状在在子子代代得得到到表表现现；亲亲代代生生物物传传递递给给子子代代一一套套实实现现与与其其相相同同形形状状的的遗遗传传信信息息。特特点点：具具稳定性。稳定性。遗遗传传型型（genotype）：又又称称基基因因型型，指指某某一一生生物物个个体体所所含含有有的的全全部基因的总和；部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。是一种内在可能性或潜力。遗传型遗传型+环境条件环境条件 表型表型表表型型（phenotype）：指指生生物物体体所所具具有有的的一一切切外外表表特特征征和和内内在在特特性性的的总总和和;-是是一一种种现现实实存存在在，是是具具一一定定遗遗传传型型的的生生物在一定条件下所表现出的具体性状。物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢代谢发育发育变变异异(variation):生生物物体体在在外外因因或或内内因因的的作作用用下下，遗遗传传物质的结构或数量发生改变。物质的结构或数量发生改变。变异的特点：变异的特点：a.a.在群体中以极低的几率出现（一般为在群体中以极低的几率出现（一般为1010-6-61010-10-10）；）；b.b.形状变化的幅度大；形状变化的幅度大；c.c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。遗传与变异的概念遗传与变异的概念饰饰变变（modification）：指指不不涉涉及及遗遗传传物物质质结结构构改改变变而而只只发发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；性状变化的幅度小；c.因因遗遗传传物物质质不不变变，故故饰饰变变是是不不遗遗传传的的。引引起起饰饰变变的的因因素素消失后，表型即可恢复。消失后，表型即可恢复。例例如如：粘粘质质沙沙雷雷氏氏菌菌：在在25下下培培养养，产产生生深深红红色色的的灵灵杆杆菌菌素素；在在37下下培培养养，不不产产生生色色素素；如如果果重重新新将将温温度降到度降到25，又恢复产色素的能力。，又恢复产色素的能力。遗传与变异的概念遗传与变异的概念二、二、遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础 1.遗传基因遗传基因 早在早在1865年，遗传学的鼻祖孟德尔用豌豆做遗传学年，遗传学的鼻祖孟德尔用豌豆做遗传学试验，得出了重要的遗传学规律试验，得出了重要的遗传学规律著名的分离定律和著名的分离定律和自由组合定律，揭示了遗传的本质：自由组合定律，揭示了遗传的本质：性性状状是是由由遗遗传传因因子子决决定定的的，性性状状的的遗遗传传是是由由于于。遗遗传传因子在子代和亲代间的传递。因子在子代和亲代间的传递。孟德尔的遗传因子后人改称为遗传基因。孟德尔的遗传因子后人改称为遗传基因。孟孟德德尔尔的的分分离离定定律律和和自自由由组组合合定定律律，就就是是成成对对基基因因在在杂杂合合状状态态中中保保持持相相对对独独立立性性，在在形形成成配配子子时时，成成对对基基因因彼彼此此分分开开，分分离离到到不不同同的的配配子子中中去去，两两种种配配子子数数相相等等，配配子子的的结结合合随随机机；两两对对或或多多对对基基因因形形成成的的配配子子，是自由组合的。是自由组合的。2.基因的物质基础基因的物质基础 孟孟德德尔尔不不仅仅发发现现基基因因是是生生物物体体遗遗传传的的基基本本单单位位，并并认认定定基基因因是是由由生生殖殖细细胞胞来来传传递递的的。当当细细胞胞核核中中的的染染色色体体被被发发现现以以后后，人人们们认认识识到到基基因因的的传传递递规规律律和和细细胞胞分分裂裂时时染色体的行为是一致的。染色体的行为是一致的。1910年年摩摩尔尔根根用用果果蝇蝇进进行行的的遗遗传传学学实实验验证证实实了了基基因因在染色体上，进而把基因和染色体联系了起来。在染色体上，进而把基因和染色体联系了起来。1928年年格里费斯的的转转化化实实验验证证明明了了染染色色体体的的化化学学成成分脱氧核糖核酸分脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质。是遗传物质。后后来来在在病病毒毒重重建建实实验验和和噬噬菌菌体体感感染染实实验验中中又又进进一一步步证证明明绝绝大大多多数数生生物物的的遗遗传传物物质质都都是是DNA，只只有有一一小小部部分分病病毒毒(包包括括动动物物、植植物物病病毒毒和和噬噬菌菌体体)没没有有DNA，它它们们的的遗传物质是核糖核酸遗传物质是核糖核酸(RNA)。第二节第二节 菌种复壮与自然选育菌种复壮与自然选育 在在微微生生物物的的遗遗传传与与变变异异这这对对矛矛盾盾中中，遗遗传传是是相相对对的，而变异是绝对的。的，而变异是绝对的。抗生素产生菌的变异主要是负变异，其表现为：抗生素产生菌的变异主要是负变异，其表现为：a.产量低，产量低，b.产孢子能力减退，产孢子能力减退，c.菌落形态不纯，菌落形态不纯，d.存活能力下降，存活能力下降，e.产色素能力改变，产色素能力改变，f.代谢活动减慢，代谢活动减慢，g.抵抗不良环境能力减弱抵抗不良环境能力减弱 这这些些变变异异是是自自然然发发生生的的不不定定向向的的、缓缓慢慢进进行行的的，是一个由量变到质变的过程是一个由量变到质变的过程 生生产产中中把把变变异异细细胞胞在在群群体体中中尚尚未未占占主主导导的的现象称为现象称为退化现象退化现象.把把变变异异细细胞胞在在群群体体中中已已占占主主导导地地位位的的现现象称为象称为变异现象变异现象 当当群群体体中中出出现现变变异异现现象象时时，则则要要把把群群体体中中的的大大量量变变异异细细胞胞除除掉掉，只只留留下下少少数数优优良良细细胞胞进进行培育，这种操作叫做行培育，这种操作叫做自然选育自然选育.菌种的复壮菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。良性状。狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种（正变）不断地从生产中选种菌种的复壮措施：菌种的复壮措施：纯种分离：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。）。通过寄主体内生长进行复壮（通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus huringiensis的复壮）；淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。采用有效的菌种保藏方法。纯化分离的方法纯化分离的方法 1.单孢子分离单孢子分离 微生物群体中存在不同类型菌落的组成，并认为是由一些亚种混合组成的。其原因是遗传基因型与环境因素共同作用的结果。因此，不可能得到绝对纯一的菌种。但通过选择可以得到相对纯一的群体。纯种的标准纯种的标准有两条：一是群体中存在的不同菌落类型数量限制在相对低的水平，例如限制在35种类型以下。二是群体中起主导作用的菌型的比例数应占绝对优势，如达到90以上，或更高的比例，如98、99以上。菌种经群体分离后证明达到以上两条标准即可认为是获得了纯株。v 任何一种微生物群体中都有占主要比例的菌落类型。这一主要类型的生理生化性状，包括产量的高低，便大体上决定了该菌株的特性。v 以“纯种”这一目标选育菌种，主要应该是提高微生物群体中主要菌型的百分比，选择主型菌落在90以上的纯株。同时辅以产量指标的选择。单孢子分离法单孢子分离法:将菌种的分生孢子制成一定浓度的分散的单孢子悬浮液，分离在平板培养基上，挑选单菌落进行筛选。在产量高于亲株的菌株中选择群体中主要菌落类型比例高于90以上的高产量纯株再进行35代连续传代试验，选择传代后生产能力仍保持原来水平范围的菌株，便是高产纯种。2.微观单孢子分离微观单孢子分离 用单孢子悬浮液分离单孢子菌落的方法很难保证获得绝对的单孢子菌落。因为在菌落生长过程中缺乏一道检查，检查每个菌落是否由单个孢子生长而成。如果单菌落不是由单个孢子长成，而是由一个以上的孢子甚至孢子团长成，那么就难以保证菌落的纯一。微观单孢子分离可以排除这个弊病，获得真正单个孢子生长形成的单菌落，以利选育得到纯一菌株。微观单孢子分离的方法微观单孢子分离的方法:在显微镜下，借助显微操纵器挑取单个发芽孢子，将每个单孢子都单独培养成单菌落。此法可确保单菌落由单个孢子发育形成。排除两个或多个孢子形成单菌落的干扰，为获得纯一菌株打下基础。挑取单孢子的方法挑取单孢子的方法:用直径为2mm的细玻璃捧拉成具有120钝角玻璃丝的挑针，在显微镜下，借助显微镜操纵器，挑取单个发芽孢子。挑针的玻璃丝长度要求不超过5mm。不能人工切断，要求拉成不足5mm长，以求针的光滑而不致伤害芽管。单个发芽孢子的制备是用斜面孢子或其它形式的固体孢子先制成单孢子悬液，在液体培养基中振荡培养1618h，使孢子发芽，以长成芽管为度。芽管的长度以不超过孢子直径为宜。因为芽管过短，不易上针，芽管过长，则容易缠在挑针上，不易下来.为了使孢子发芽适度，必须使用稀释的液体培养基。培养基浓度不要太大，避免养分过于丰富而控制不住孢子的生长。孢子的发芽培养时必须控制较低的温度。常用的培养温度为1618，目的是延缓孢子的生长发育，控制其发芽使产生适度的芽管。然后用毛细管将发芽适度的单孢子液滴在盖玻片上，在不远处再滴上空白液体培养基。此盖玻片覆盖在特制的玻璃小室上。玻璃小室为高约10mm的玻璃圆环，可使挑针伸入。在显微镜下找到单个的发芽孢子后，将挑针移入该孢子的右侧慢慢上抬。靠挑针进入液体时的振动，发芽的单孢子便吸到挑针上，挑上发芽孢子后，便将挑针慢慢下移，移至空白培养基液滴中放入。当挑针插入液滴时，针上的发芽孢子便借针入液体时的振动而离开挑针进入培养液中。用显微镜检查液滴中是否有移入的发芽孢子，同时检查是否是单个孢子。在确证已挑上单个孢子后，则将剩余的孢子液滴用酒精棉擦去。酒精棉宜小，用大头针裹少许脱脂棉捻紧，蘸上75消毒酒精挤干,轻轻将单孢子液滴擦掉，特别要注意少量棉丝有可能把需要保留的液滴在无意中吸掉。如此将盖玻片置凹球片上，在适宜的温度和湿度下培养，每天观察，待菌丝长满培养液滴时，用灭菌小铲取一小簿片无菌的洋菜固体培养基，置于生长的单孢子菌丝体边。或用毛细管吸取稀的洋菜培养基滴于液滴边。使单孢子发育的菌丝继续生长在洋菜块上。每天观察，待长满洋菜块后，再用灭菌小铲将单孢子菌丝体移种至斜面，继续培养到长成单菌落。每批微观单孢子分离需挑3050个单个孢子，长成单菌落后进行筛选。