实验记录-Western-Blot之染色与显影.docx

Western blot之加抗体及显影.加一抗：根据你的实验目的及一抗说明书配制一抗，将封闭好的膜用TBST溶液在摇床上 洗膜3次，每次5min,加入5ml配置好的一抗溶液，室温2小时或者4低温摇床过夜；记 得要回收一抗，放4冰箱可重复使用；1 .加二抗：回收完一抗后，将膜用TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次lOmin,加入二抗稀 释液（二抗：TBST=1： 2000）,室温摇床1小时，再用TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次 lOmin；.显影：洗膜后加入ECL显色剂（溶液1：溶液2=1： 1） , 2min后可显影，记得保存图片。考前须知抗体杂交过程涉及一抗和二抗杂交时间、抗体的浓度等关键因素，考前须知如下。（1） 一抗的选择优先选择单抗，一抗的初次实验浓度参考抗体说明书建议的稀释倍数，一 般选择中值即可。如说明书推荐稀释倍数为（1： 100）（1： 1000）,初次可采用1： 500o 一抗浓度过高会导致非特异性条带产生。（2）对于蛋白浓度较低的样本，可以通过适当增加上样量或增加一抗浓度，提高检测灵敏 度。（3） 一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18h）不等，具体取决于抗体与蛋白 的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。 如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4进行，否那么会产生污染而破坏蛋白（特别是磷酸基 团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。（4）二抗浓度的选择参考一抗的选择方法，二抗浓度过高或孵育时间过长会导致背景加深 并产生非特异性条带。二抗通常在室温条件下孵育lh即可。