牛栏山酒厂清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定fgou.docx

牛栏山酒酒厂清香香大曲及及酒醅中中地衣芽芽孢杆菌菌的分离离鉴定作者: 刘桂君君 闻泽泽喜 胡胡建华 郝文军军 刘红红霞 李李兰英 关闭本页 转载于：中国酿酒工业协会发布时间：2009-06-02T11:25:00    牛栏山山酒厂清清香大曲曲和酒醅醅中共分分离出223株芽芽孢杆菌菌，通过过一系列列生理生生化实验验包括柠柠檬酸盐盐与丙酸酸盐利用用实验、产产酶实验验、需厌厌氧实验验、V.P实验验、酪素素水解实实验、酪酪氨酸水水解实验验、酸性性培养基基实验、耐耐盐性实实验、生生长温度度实验、产产酱香实实验，综综合各项项实验性性能指标标，鉴定定出122株地衣衣芽孢杆杆菌，鉴鉴定结果果与中国国发酵工工业研究究院分子子鉴定结结果一致致，本文文为地衣衣芽孢杆杆菌的鉴鉴定提供供一套比比较简便便、易行行的方法法。     关关键词   地衣衣芽孢杆杆菌、牛牛栏山酒酒厂、生生理生化化实验、基基酒    芽孢杆杆菌是大大曲中常常见微生生物，也也是重要要类群之之一。地地衣芽孢孢杆菌一一直以来来被认为为是酱香香型白酒酒高温大大曲中特特有的微微生物，就就我们研研究发现现，在牛牛栏山酒酒厂生产产用的多多种清香香大曲、出出池酒醅醅中同样样存在地地衣芽孢孢杆菌，对对分离出出23株株芽孢杆杆菌进行行生理生生化实验验，鉴定定出122株地衣衣芽孢杆杆菌，鉴鉴定结果果与中国国食品发发酵工业业研究院院分子鉴鉴定结果果一致。本本文主要要介绍地地衣芽孢孢杆菌的的生理生生化鉴定定实验方方法，为为地衣芽芽孢杆菌菌的鉴定定提供比比较完备备的一套套方法。    1 地衣芽孢杆菌的分离    1.1材料    牛栏山酒厂生产用清香大曲、酿酒车间酒醅    1.2分离用培养基    肉汁培养基：牛肉膏0.3，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，琼脂2.0，pH 7.0-7.2，121，灭菌30min。    1.3分离方法    取大曲干粉或酒醅0.5g，加入带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇床培养30min，60水浴30min，然后用接种环蘸取，在肉汁培养基平板上划线分离。挑取单菌落继续划线分离，直到得到单菌落纯菌株为止。    2 地衣芽孢杆菌生理生化鉴定实验    根据上述分离培养基和分离方法，共计分离得到芽孢杆菌23株，编号分别为1、2、3、422、23，接下来通过实验对这些菌株进行筛选和鉴定。地衣芽孢杆菌鉴定参考伯杰氏细菌鉴定手册及常见细菌系统鉴定手册（东秀珠，蔡妙英等编著）的方法，有所改进，以下为具体的生理生化实验鉴定方法。    2.1柠檬酸盐与丙酸盐利用实验    某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯一碳源，并利用磷酸铵作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。培养基配方：柠檬酸钠（或丙酸钠）0.2，NaC1 0.5，MgSO47H2O 0.01，(NH4)2HPO4 0.1，K2HPO43H2O 0.1，1%溴百里酚蓝水溶液10ml，琼脂2。以上成分除指示剂外其余加热溶解，调节pH6.8-7.0，并加入指示剂，使培养基呈草绿色，分装试管，灭菌后摆斜面。取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3-7d，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者为阴性。只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸钠，为阳性反应，而其他芽孢杆菌均不能利用丙酸钠，为阴性反应，但很多种芽孢杆菌都可以利用柠檬酸钠。      2.2产酶酶实验     2.22.1过过氧化氢氢酶实验验过氧化化氢酶又又称接触触酶，能能催化过过氧化氢氢分解水水和氧。将将芽孢杆杆菌接种种于肉汁汁培养基基斜面上上，适温温培养118-224h。取取干净的的载玻片片，在上上面滴11滴3-5的的H2OO2，挑挑取1环环培养118-224h的的菌苔，在在H2OO2溶液液中涂抹抹，若有有气泡（氧氧气）出出现，则则为过氧氧化氢酶酶阳性，无无气泡者者为阴性性。也可可将过氧氧化氢溶溶液直接接加到菌菌种斜面面上，观观察气泡泡的产生生。     22.2.2淀粉粉酶实验验     某些些细菌可可以产生生分解淀淀粉的酶酶，把淀淀粉水解解为无色色糊精等等小分子子，或进进一步水水解为麦麦芽糖或或葡萄糖糖。淀粉粉水解后后，遇碘碘不变蓝蓝色。     培养基基：在肉肉汤蛋白白胨琼脂脂中添加加0.22的可可溶性淀淀粉，分分装三角角瓶，1121 200minn灭菌备备用。卢卢戈氏(Luggol)碘液：碘片11g，碘碘化钾22g，蒸蒸馏水3300mml，先先将碘化化钾溶解解在少量量水中，再再将碘片片溶解在在碘化钾钾溶液中中，混匀匀，定容容。     将将灭菌后后放入培培养基冷冷却到550左左右，倒倒成平板板，凝固固后，取取18-24hh的纯培培养物点点于平板板上，每每皿可点点种3-5个菌菌株，适适温培养养2-44d，形形成菌落落后，在在平板上上滴加卢卢戈氏碘碘液，以以铺满菌菌落周围围为度，平平板成蓝蓝色。如如果菌落落周围有有无色透透明圈出出现，说说明淀粉粉已经被被水解，实实验为阳阳性，否否则为阴阴性。透透明圈的的大小一一般说明明水解淀淀粉的能能力。     2.22.3 纤维素素酶实验验     采用用刚果红红染色法法，如果果有刚果果红存在在，刚果果红可以以与纤维维素结合合成红色色螯合物物，培养养基颜色色为红色色。如果果培养基基中有能能够产纤纤维素酶酶的细菌菌，将纤纤维素分分解，不不能形成成螯合物物，在菌菌落周围围形成透透明圈。这这样可以以鉴定产产纤维素素酶的细细菌。     培养基基的配制制：CMMC-NNa 55-100g，酵酵母膏 1g，KKH2PPO4 0.225g，琼琼脂155g，将将上述物物质溶解解后,用用蒸馏水水定容到到10000mll，加入入5mll 100mg/ml的的刚果红红溶液，1121，灭菌菌20mmin，冷冷却倒平平板，凝凝固后待待用。取取18-24hh的培养养物点于于平板上上，每皿皿可点种种3-55个菌株株，适温温培养22-4dd，形成成菌落后后，观察察产生透透明圈情情况，产产生纤维维素酶的的菌落周周围将会会出现明明显的透透明圈，否否则为阴阴性。     2.22.4明明胶液化化实验     明胶是是一种动动物性蛋蛋白，明明胶的水水解是由由于有些些细菌具具有明胶胶酶（亦亦称类蛋蛋白水解解酶），能能将明胶胶先水解解为多肽肽，又进进一步水水解为氨氨基酸，失失去凝胶胶性质而而液化。明明胶培养养基本身身低于220凝凝固，高高于244则自自行液化化。明胶胶分解后后，其分分子变小小，虽在在低于220的的温度下下也不再再凝固。培培养基：蛋白胨胨5g，明明胶1220g，蒸蒸馏水110000ml，调调节pHH7.22-7.4，分分装试管管，培养养基高度度约4-5cmm，1115 20mmin灭灭菌。     挑取118-224h培培养物，以以穿刺法法接种于于试管中中央，于于20-22培养。每每天观察察结果，液液化为阳阳性，否否则为阴阴性。     2.33需厌氧氧实验     在培养养基中加加入还原原剂，如如巯基醋醋酸钠和和甲醛合合次硫酸酸钠等，以以除去培培养基中中的氧气气或氧化化型物质质，使厌厌氧菌能能在有氧氧情况下下生长。培培养基：酪素水水解物220g，NNaC11 5gg，巯基基醋酸钠钠HSCH22COOONa 2g，甲甲醛合次次硫酸钠钠HOCCH2SO22Na 1g，琼琼脂155g，蒸蒸馏水110000ml，调调节pHH 7.2，分分装试管管1211灭菌菌20mmin，培培养基不不摆斜面面。     用用1环肉肉汤菌液液，穿刺刺接种到到上述培培养基中中，必须须穿刺到到管底。330培培养3-7d观观察结果果。如细细菌在琼琼脂柱表表面上生生长者为为好氧菌菌，如沿沿着穿刺刺线生长长者为厌厌氧菌或或兼性厌厌氧菌。    2.4乙酰甲基甲醇实验(V.P实验)    某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V.P阳性反应。培养基：蛋FS:PAGE白胨5g，葡萄糖5g，NaC1 5g，蒸馏水1000ml。调节pH7.0-7.2，分装试管，每管约装4-5ml，115灭菌20min。试剂：40NaOH（或KOH），肌酸。    接种于上述培养液中，适温培养4-6d。如为阴性，可适当延长培养时间。取培养液（约2ml）和等量的40NaOH相混合，加少量（约0.5-1.0mg）肌酸，充分振荡2-5min，如培养液出现红色即为阳性。有时需放置更长时间或在热水中稍加热，以加速反应进行。  2.5酪素素水解实实验     牛牛奶平板板的制备备：取55g脱脂脂奶粉加加入500ml蒸蒸馏水中中（或用用50mml脱脂脂牛奶），取取1.55g琼脂脂溶于550mll蒸馏水水中，将将两溶液液分开灭灭菌。待待冷至445-550时时，将两两液混匀匀倒平板板，即成成牛奶平平板。将将平板倒倒置过夜夜，使表表面水分分干燥，然然后将菌菌种点接接在平板板上，每每皿可点点接3-5个株株菌。适适温培养养3-55d，记记录菌落落周围和和下面酪酪素是否否已被分分解而呈呈透明。配配制该培培养基时时，切勿勿将牛奶奶和琼脂脂混合灭灭菌，以以防牛奶奶凝固。    2.6酪氨酸水解实验    有些细菌具有酪氨酸酶，能使含酚类的化合物如酪氨酸、酚等氧化成醌，再经脱水、聚合等一系列反应，最后形成黑色沉淀物质。培养基：采用肉汤蛋白胨培养基加0.1L-酪氨酸，调节pH为7.0，分装121灭菌20min后摆成斜面。接种后培养3-7d，观察斜面有黑色素者为阳性反应。    2.7酸性培养基实验    培养基：蛋白胨10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，调节pH 5.7，115灭菌20min。取菌液一环，接种于上述培养基中，同时接种普通肉汤液（pH 7.0）作对照。适温培养1-3d内观察生长情况。该培养液要求十分澄清，pH必须准确，用pH计调测。    2.8耐盐性实验    耐盐性实验是观察渗透压对细菌生长的影响。由于不同菌类耐盐性不同，故常以此作为鉴别特征。一般可根据不同种类的菌株，选择其适合生长的培养基，在其中加入不同量的NaCl，接种后观察其生长与否，以判断其耐盐性。    根据鉴定需要，以肉汤培养液配成不同浓度NaCl溶液，如2、5、7、10等。培养基要求十分澄清，接种时应采用幼龄菌液接种，适温培养3-7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。    2.9生长温度实验    细菌生长的最高、最适、最低温度，常常是某些细菌鉴定的特征之一。测定细菌的生长温度，要求培养液十分澄清（如营养肉汁培养基），并采用液体菌种直接接种，放置于恒温水浴培养。在指定温度下培养2-5d，观察生长情况。若在接近0的低温培养，则观察时间可延长7-10d或更长。培养5d能生长者按生长计算，否则按不生长计算，可疑者需重新进行培养实验。    2.10产酱香实验    地衣芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的一个重要作用就是产生酱香物质，这与其产生蛋白酶类有关，蛋白酶将蛋白质分解成肽类和氨基酸，经过发酵会产生酱香物质。本实验采用三种培养基鉴定地衣芽孢杆菌是否产生酱香物质。    甘氨酸培养基：甘氨酸5g，葡萄糖10g，NaCl 3g，蒸馏水1000ml，pH 6-7，分装50ml到100ml三角瓶中，121灭菌20min。营养肉汁培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.4，分装50ml到100ml三角瓶中，121灭菌30min。以上两种培养基均为液体培养基，取培养18-24h菌种接入到液体培养基中，摇床37培养48-60h，取出，鉴定是否产生酱香物质。    麸皮培养基：麸皮1000g，NaOH 6g，蒸馏水600ml，分装到500ml三角瓶中，121灭菌40min。接入液体培养菌种10，恒温箱培养3-5d，取出，鉴定是否产生酱香物质。    2.11糖发酵实验    糖发酵实验主要是看该种糖能不能被微生物利用，如果能够利用则会发酵产酸，培养基中的指示剂会由紫色变黄色，同时可能伴有气泡产生，如果发酵产气则试管中倒扣的杜氏管中培养基会被排出，里面充满气体。本实验中糖发酵实验选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖等。培养基配方为：(NH4)2HPO4 1g，MgSO47H2O 0.2FS:PAGEg，KC1 0.2g，酵母膏0.2g，糖或醇类10g，蒸馏水1000ml，0.04溴甲酚紫乙醇溶液20ml，调节pH 7.0-7.2，分装试管，每管装10ml培养基，试管内放有杜氏发酵管，115灭菌20min，排净杜氏管中的空气。    以18-24h的幼龄菌种，接种一环到上述培养基中，适温培养3-5d，观察指示剂是否由紫色变黄，杜氏管中是否有空气。      3生生理生化化实验鉴鉴定结果果（具体体结果见见附表11，2，33）     33.1柠柠檬酸盐盐与丙酸酸盐利用用实验结结果     223个菌菌株均可可以利用用柠檬酸酸盐，这这也与多多种芽孢孢杆菌都都可以利利用柠檬檬酸钠的的特征符符合。只只有地衣衣芽孢杆杆菌可以以利用丙丙酸盐，22、55、88、110、113、114、116、117、118、119、221、222这这12株株均可以以利用丙丙酸盐，可可以初步步认为这这12株株为地衣衣芽孢杆杆菌，还还需要其其他的生生理生化化实验来来验证。    3.2淀粉酶实验结果    实验的23个菌株中，11菌株不能水解淀粉，未产生透明圈。3、7、9三个菌株产生的透明圈最大，几乎铺满整个平板，其余各个菌株产生的透明圈大小不一。各个菌株水解淀粉的能力各不相同，3、7、9三个菌株水解淀粉的能力最强，在初步筛选出的12株地衣芽孢杆菌中，5菌株产淀粉酶能力较强，21产淀粉酶能力较差。透明圈如图1,2,3,4,5,6。    3.33酪素水水解实验验结果     牛奶的的重要组组成成分分为酪蛋蛋白，所所以配制制牛奶琼琼脂培养养基，如如果菌株株可以利利用酪蛋蛋白则产产生透明明圈，给给人的印印象很直直接。在在实验菌菌株中，11、33、77、99菌株株产生的的透明圈圈最大，其其中接种种9菌菌株的平平板完全全变为透透明的，说说明水解解酪素的的能力最最强。其其余菌株株对酪素素水解能能力各不不相同。    3.4明胶液化实验结果    在明胶液化实验中，1、2、3、4、7、8、9、11、12、16、17菌株液化明胶的能力最强，接种7d后就将明胶全部液化。说明这些菌株产生的类蛋白酶类丰富，使明胶水解迅速。在所有菌株中，6、19对明胶的液化能力最弱。    3.5产酱香实验结果    地衣芽孢杆菌是酱香大曲中的重要微生物，能够产生酱香物质，实验的23个菌株均是从清香大曲和酒醅中分离得到的，因此我们对其是否产酱香进行确认。通过两种液体培养基（甘氨酸培养基和营养肉汁培养基）和麸皮固体培养基发酵培养，我们发现这些菌株虽然能够产生酱香物质，但酱香气味不典型，不明显，而且每个菌株产生的味道都各不相同。   44.地衣衣芽孢杆杆菌分子子鉴定实实验     对对以上经经过生理理生化实实验筛选选出来的的地衣芽芽孢杆菌菌进行分分子鉴定定。从地地衣芽孢孢杆菌中中提取116S rDNNA片段段，通过过测序获获得166S rrDNAA序列信信息，再再与166S rrDNAA数据库库或其他他数据库库进行比比较，从从而鉴定定种类。本本实验与与中国食食品发酵酵工业研研究院合合作完成成。     鉴鉴定中用用到的两两对细菌菌通用引引物是WWBACC1/WWBACC2和3341/5344。DNNA提取取采用煮煮沸法和和TIAANGEEN试剂剂公司的的细菌基基因组提提取试剂剂盒两种种提取方方法，DDNA纯纯化使用用上海申申能博彩彩琼脂糖糖凝胶回回收纯化化试剂盒盒。采用用美国AABI 97000型PPCR仪仪进行扩扩增。     由上海海生工生生化公司司测序，将将测定的的序列处处理后提提交到NNCBII的Geene Bannk进行行序列比比对，与与Baccilllus licchennifoormiis（地地衣芽孢孢杆菌）的的一致率率达到1100。鉴定定结果为为地衣芽芽孢杆菌菌。    5. 总结与与讨论     5.11从大曲曲和酒醅醅中分离离微生物物，600水浴浴30mmin可可以排除除酵母、霉霉菌等的的干扰，而而芽孢杆杆菌也不不会死亡亡，所以以该方法法比较容容易分离离得到纯纯芽孢杆杆菌菌株株。     55.2只只有地衣衣芽孢杆杆菌可以以利用丙丙酸盐，所所以是否否利用丙丙酸盐可可以作为为鉴定地地衣芽孢孢杆菌的的一个重重要依据据，但是是其他生生理生化化实验同同样是必必不可少少的。     5.33 在产产酶实验验中，所所有菌株株均产生生过氧化化氢酶，这这与芽孢孢杆菌的的性质相相符合，但但是分离离得到的的所有芽芽孢杆菌菌均不产产纤维素素酶。产产淀粉酶酶实验中中，淀粉粉水解是是逐步进进行的过过程，与与菌种产产生淀粉粉酶的能能力、培培养时间间，培养养基淀粉粉含量和和pH等等均有一一定关系系。培养养基必须须为中性性或微酸酸性，以以pH77.2最最适。     5.44 地衣衣芽孢杆杆菌产酱酱香不典典型，因因为这些些菌株都都是从清清香大曲曲和酒醅醅中分离离的，所所以在发发酵过程程中的所所起的作作用也各各不相同同，产酱酱香不典典型的特特征正好好可     以以应用到到二锅头头酒的生生产中，不不会将酒酒的香型型改变，而而且还可可以增加加酒体的的醇厚度度。     55.5全全部的生生理生化化实验都都是与地地衣芽孢孢杆菌的的特征相相对应的的，结合合丙酸盐盐利用实实验和一一系列的的生理生生化实验验可以基基本鉴定定地衣芽芽孢杆菌菌。本文文为地衣衣芽孢杆杆菌的鉴鉴定提供供了简便便、易行行的实验验方法。    参考文文献:     1.中中国科学学院微生生物研究究所伯杰杰氏细菌菌鉴定手手册翻译译组译，伯伯杰氏细细菌鉴定定手册 (第八八版).北京：科学出出版社.19884     22.东秀秀珠，蔡蔡妙英等等编著，常常见细菌菌系统鉴鉴定手册册.北京京：科学学出版社社.2000116