实验四、基因组DNA的提取和检测(阳成伟).ppt

实验四、基因组实验四、基因组DNA的提取的提取准备：一次性手套、65水浴锅、氯仿、无水乙醇、1.5离心管、菜花实验目的：实验目的：1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。2.了解基因组DNA的实验用途。3.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。材料：材料：花椰菜花椰菜/昆虫昆虫组织设备：移液器，高速离心机，移液器，高速离心机，水浴锅，水浴锅，培养箱培养箱。试剂：试剂：1.CTAB组织组织消化液消化液2.氯仿3.无水乙醇4.TE缓冲液CTAB溶液配制2%CTAB溶液：100mmol/L Tris-HCl,pH7.0；1.4mol/L NaCl；20mmol/L EDTA；2%CTAB.10mlfinalconc.（终浓终浓度）度）CTAB0.2g2%H2O5.78ml1MTris-HCl1.0ml100mM5MNaCl2.8ml1.4M0.5MEDTA0.4ml20mM实验原理（实验原理（CTAB法）法）CTAB，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可使细胞破裂，释放出核酸；CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解释放出来的DNA（DNA在2mol/LNaCl中DNA具有较高的溶解度）；加入无水乙醇，可以使DNA从溶液中沉淀出来。实验步骤（常温操作，实验步骤（常温操作，2人一组）人一组）1.取适量(300-500mg)植物组织，加入2ml CTAB抽提缓冲液，充分匀浆2-3min，然后每人每人转移700ul的匀浆液至一支1.5ml离心管中，65水浴水浴45min（中（中间摇动间摇动2-3次）次）（裂解细胞，释放核酸和蛋白）；2.加入700ul的氯仿，上下摇动2-3min(此步是萃取组织液中的蛋白质；务务必必带带上手套！上手套！）；3.12000rpm离心10min，取400ul上清液转移至一支1.5ml离心管中（由于此时悬液已经分层，而我们需要取最上层的溶液，所以注意千万不要使枪头触碰到中间的杂质层，当然，更不能取吸取下层的萃取液了）；4.加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2）（40ul），上下颠倒3-4次混匀；然后再加入2倍体积的无水乙醇（0.9ml)，上下颠倒3-4次混匀（如DNA量大，此时可见絮状DNA沉淀。（如果放置于-20度过夜，DNA产率会更多！）5.12000rpm离心5min，缓缓倒掉上清液（剩余的液体可以用移液器吸走），管底的沉淀即DNA（无色透明胶状物！）；6.加入200ulTE缓冲液（含50ug/ml RNase），轻轻弹管底，以弹管底，以溶解溶解DNA；也可以用枪头缓慢地来回吸放液体来帮助溶解；也可以用枪头缓慢地来回吸放液体来帮助溶解DNA。此时应该可以看到片状的。此时应该可以看到片状的DNA沉淀物逐渐变少，最沉淀物逐渐变少，最终消失终消失。（一定要使DNA完全溶解于TE中，否则影响电泳效果！）；7.将DNA溶液置于37 培养箱或水浴中30min（降解残留的RNA）；8.-20 保存备用。9.取510ulDNA（加适量loading buffer）电泳检测；取2ulDNA测定浓度和OD260/280（下次课电泳检测）。基因组基因组DNA的检验（纯度）的检验（纯度）紫外分光光度法：紫外分光光度法：核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰1.7OD260/OD2802.0基因组基因组DNA的检验（完整性）的检验（完整性）凝胶电泳法：凝胶电泳法：基因组基因组DNADNA电泳，在电场中泳动慢，如果发电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 123456材料质量（mg）100300500100300500所加TE体积（ul）200200200400400400260/2802.031.971.922.072.022.01260/2302.102.312.192.051.952.02浓度（ng/ul）254.5454.4569.5139.6262.1320.0上样2ul上样8ul注：1-6序号分别与表中对应。核酸的贮存DNA保存1 1）短期贮存：）短期贮存：4 4或或-20-20存放于存放于TETE（TrisTris和和EDTAEDTA）缓冲液中。缓冲液中。TETE缓缓冲冲液液(PH(PH为为8 8.0).0)，可可减减少少DNADNA脱脱氨氨反反应应；EDTAEDTA可可以抑制以抑制DNaseDNase的活性。的活性。2 2）长期贮存：）长期贮存：TETE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年保存数年；无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是等盐离子，作用是中和核酸分子表中和核酸分子表面的负电荷，减少分子间的排斥力，有助于分子之间的聚面的负电荷，减少分子间的排斥力，有助于分子之间的聚集集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，沉淀析出，基因组基因组DNA提取的用途提取的用途构建基因组文库构建基因组文库Southern杂交杂交RFLP基因克隆（基因克隆（PCR）下次课程质粒DNA的提取及质量检测