血液分子生物学细胞培养技术讲课稿.ppt

血液分子生物学细胞培养技术、光学显微镜、光学显微镜（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜（二）荧光显微镜（二）荧光显微镜（二）荧光显微镜（二）荧光显微镜 细胞中有些物质，受紫外线照射细胞中有些物质，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。究的工具之一。荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目除紫外线，用以保护人目。荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）（三）激光共聚焦扫描显微境（三）激光共聚焦扫描显微境 激光共聚焦扫描显微镜（激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope，ICSM）用激）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜 LCSM照片照片蓝色为细胞核蓝色为细胞核绿色为微管绿色为微管 观察细胞形态观察细胞形态细胞内生化成分的定量细胞内生化成分的定量分析分析光密度统计以及细胞形光密度统计以及细胞形态的测量态的测量（四）倒置显微镜）倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒。倒置显微镜的物镜在载物台之下。用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。二、电子显微镜二、电子显微镜（一）透射电子显微镜一）透射电子显微镜1.基本原理基本原理 在光学显微镜下无法看清小于在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微的细微结构，这些结构称为亚显微结构（结构（submicroscopicstructures）或超微结构（）或超微结构（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）。）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。率。1932年年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前高波长越短。目前TEM的分辨力可达的分辨力可达0.2nm。电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（切片机（ultramicrotome）制作。）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统、电源系统等系统等5部分构成。部分构成。2.制样技术制样技术 1）超薄切片）超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金属盐 染色，以增大反差。2 2）负染技术）负染技术）负染技术）负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达分辨力可达分辨力可达分辨力可达1.5nm1.5nm左右。左右。左右。左右。肌动蛋白纤维的负染电镜照片肌动蛋白纤维的负染电镜照片 3 3）冰冻蚀刻）冰冻蚀刻）冰冻蚀刻）冰冻蚀刻 冰冻蚀刻（冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本）。标本置于置于-100C的干冰或的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。的液氮中，进行冰冻。用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（出断面结构，称为蚀刻（etching）。）。蚀刻后，向断面以蚀刻后，向断面以45度角度角喷涂一层蒸汽铂，再以喷涂一层蒸汽铂，再以90度角度角喷涂一层碳，加强反差和强度。喷涂一层碳，加强反差和强度。用次氯酸钠溶液消化样品，把用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（复膜（replica）。）。复膜显示出标本蚀刻面的形态，复膜显示出标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。本中细胞断裂面处的结构。（二）扫描电子显微镜（二）扫描电子显微镜 扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope）于）于20世纪世纪60年年代问世，用来观察标本的表面结构。代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了级电子，图像为立体形象，反映了标本的表面结构。标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。轰击下发出次级电子信号。人类血细胞人类血细胞SEM照片照片 显微操作/注射仪 显微操作技术显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作微操作/注射仪注射仪（micromanipulator）进行细胞或）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。早期胚胎操作的一种方法。显微操作技术包括细胞核移植、显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，已有几十年的历史，细胞培养技术The techniques of cell culture 细胞培养的概念细胞培养的概念细胞培养的概念细胞培养的概念 摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营摹拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使细胞在体外生存并维持其结构和功养条件下，使细胞在体外生存并维持其结构和功能的方法。能的方法。选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。究的技术。细胞培养细胞培养：使用单个细胞悬液：使用单个细胞悬液组织培养组织培养：使用组织块（：使用组织块（O.51立方毫立方毫米）或薄片（厚米）或薄片（厚0.2毫米）毫米）器官培养器官培养：使用器官原基或器官的一部：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫分或整个器宫 传代传代（passage）细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的培养细胞的培养细胞的培养细胞的“一代一代一代一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-63-6次。次。次。次。原代培养原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。代培养。代培养。代培养。原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿 原代培养期原代培养期原代培养期原代培养期 传代期传代期传代期传代期 衰退期衰退期衰退期衰退期细胞系（细胞系（cellline）原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。有限细胞系（有限细胞系（finitecellline）细胞系的生存期有限。细胞系的生存期有限。细胞系的生存期有限。细胞系的生存期有限。无限细胞系（无限细胞系（infinitecellline）已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性。异体接种致癌性。异体接种致癌性。异体接种致癌性。有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性。永生性和永生性和永生性和永生性和恶变恶变 *永生性：是永生性：是永生性：是永生性：是细细胞胞胞胞获获得持得持得持得持续续生生生生长长增殖能力的特性增殖能力的特性增殖能力的特性增殖能力的特性 *永生性的永生性的永生性的永生性的细细胞不一定具有胞不一定具有胞不一定具有胞不一定具有恶恶性性性性,但却易演但却易演但却易演但却易演变变成成成成 恶恶性性性性细细胞胞胞胞 细胞株（细胞株（cellstrain）通过选择法或克隆形成法从原代培养通过选择法或克隆形成法从原代培养 物或细胞系中获得具有特殊性质或标物或细胞系中获得具有特殊性质或标 志物称为细胞株。志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个细胞株的特殊性质或标志必须在整个 培养期间始终存在。培养期间始终存在。再由原细胞株进一步分离培养出与原再由原细胞株进一步分离培养出与原 株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株性状不同的细胞群，亦可称之为亚 株（株（substrainsubstrain）。）。克隆（克隆（clone）亦称无性繁殖系或简称无性系。亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先对细胞来说，克隆是指由同一个祖先 细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一 致的细胞群。致的细胞群。二倍体细胞（二倍体细胞（diploidcells）染色体数目与原供体二倍细胞染色体数相同或基本染色体数目与原供体二倍细胞染色体数相同或基本 相同（相同（2n2n细胞占细胞占7575或或 80 80以上）的细胞群。以上）的细胞群。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限 细胞系。细胞系。二倍体二倍体细细胞可能胞可能长长期保持二倍体状期保持二倍体状态态，长长期期传传代后代后,会会发发生偏离二倍体生偏离二倍体现现象，有象，有时时出出现现异形染色体。异形染色体。培养培养细胞的生胞的生长方式方式 1.1.贴贴附型附型附型附型 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞；必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞；成成纤维型型细胞；上皮型胞；上皮型细胞；游走型胞；游走型细胞；多形型胞；多形型细胞胞2.2.悬悬浮型浮型浮型浮型 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。血系统肿瘤细胞。血系统肿瘤细胞。血系统肿瘤细胞。上皮型上皮型 成纤维型成纤维型悬浮型悬浮型 成纤维型成纤维型每代贴附生长细胞的生长过程游离期游离期贴壁期贴壁期潜伏期潜伏期对数生长期对数生长期停止期（平台期）停止期（平台期）游离期：游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状，也细胞接种后在培养液中呈悬浮状，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。球形。10分钟一分钟一4小时小时贴壁期贴壁期细胞附着于细胞附着于底物底物上，游离期结束。细胞株平均在上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一分钟一4小时贴小时贴壁。壁。底物底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有进口塑料培养瓶涂有生长基质生长基质（化学合成的功能基团）。（化学合成的功能基团）。潜伏期潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。最适合进行实验研究。停止期（平台期）停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。机制：接触抑制、密度依赖性。培养细胞生存环境、条件和代谢培养细胞生存环境、条件和代谢一、无污染环境一、无污染环境*体内体内:有强大的免疫系统和解毒器官有强大的免疫系统和解毒器官*体外体外:细胞失去了对微生物和有毒物细胞失去了对微生物和有毒物质的防御能力质的防御能力 二、温度二、温度二、温度二、温度 *标准温度标准温度:36.50.50.5 *细胞对低温的耐受力比对高温强细胞对低温的耐受力比对高温强 *39-40 1 *39-40 1小时小时:细胞受到一定损伤细胞受到一定损伤 *41-42 1 *41-42 1小时小时:细胞受到严重损伤细胞受到严重损伤 *43 1 *43 1小时小时:细胞死亡细胞死亡 *1-20:*1-20:细胞代谢低下细胞代谢低下,但不损伤细胞但不损伤细胞 *25-35:*25-35:细胞能生长细胞能生长,但速度减慢但速度减慢 *0 *0以下以下:细胞因胞质结冰而死亡细胞因胞质结冰而死亡,但加保护但加保护 剂剂(二甲基亚砜二甲基亚砜),),冻存于液氮中冻存于液氮中(-196),(-196),能能 长期保存长期保存 三、气体环境和氢离子浓度三、气体环境和氢离子浓度主要有氧气和二氧化碳主要有氧气和二氧化碳氧气氧气:*封闭式培养封闭式培养,氧分压氧分压1995-9975Pa.*开放式培养开放式培养,95%空气加空气加5%二氧化碳二氧化碳*氧分压超过大气中氧含量氧分压超过大气中氧含量,对细胞产生对细胞产生毒害作用毒害作用 二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳 *细胞代谢产物细胞代谢产物,也是细胞所需成分也是细胞所需成分 *主要作用在于能维持培养基的主要作用在于能维持培养基的pHpH值值 *pH 7.2-7.4.*pH 7.2-7.4.*原代培养细胞对原代培养细胞对 pH pH的变动耐受差的变动耐受差 *细胞系耐受力强细胞系耐受力强 *细胞耐酸性比耐碱大一些细胞耐酸性比耐碱大一些实验准备实验准备实验用品：实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱培养箱倒置显微镜倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震荡器液氮液氮罐罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管冻存管压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广：湿热消毒，用途广电电热热干干燥燥箱箱：干干热热消消毒毒（160，2小小时时）。主主要要用用干干玻璃器皿消毒玻璃器皿消毒滤滤器器：过过滤滤除除菌菌：大大多多数数培培养养用用液液，如如人人工工合合成成培培养养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台超净工作台：为细胞操作提供无菌环境：为细胞操作提供无菌环境紫紫外外灯灯：紫紫外外线线消消毒毒。主主要要用用于于培培养养室室空空气气、操操作作台台、塑料培养皿和培养板等表面消毒塑料培养皿和培养板等表面消毒n超净工作台的工作原理超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成作台面，使工作台内构成无菌环境。无菌环境。超净工作台超净工作台CO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37，5CO2。使用使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问培养箱培养细胞时应注意的问题：题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，松，以保证通气。以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h)。箱内火菌蒸馏水箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中毫升蒸馏水槽中以保以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。持箱内湿度，避兔培养液蒸发。CO2培养箱培养箱培 养 板培养瓶 消化液消化液消化液消化液 胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞胞间间粘粘蛋蛋白及糖白及糖蛋白，蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰胰蛋蛋白白酶酶是是一一种种黄黄白白色色粉粉末末，用用无无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓缓冲冲液液配配制制常常 用的胰蛋白酶液浓度是用的胰蛋白酶液浓度是0.250.25 。用滤器过滤除菌。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。基和合成培养基。基和合成培养基。基和合成培养基。天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。缺点：来源受限。缺点：来源受限。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染易发生支原体污染易发生支原体污染易发生支原体污染合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。模拟合成的。模拟合成的。模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如目前已设计出许多种培养基，如目前已设计出许多种培养基，如目前已设计出许多种培养基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-1640RPMI-1640、DMEMDMEM等。等。等。等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。其它一些辅助物质。其它一些辅助物质。其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。成本低。成本低。成本低。缺点：缺点：缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）需补充一定量的天然培养基（如血清）需补充一定量的天然培养基（如血清）需补充一定量的天然培养基（如血清）血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶 原等。各种生长因子 转移蛋白 不明成分一般说来含一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加持细胞不死但支持细胞生长一般需加10血清血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞迫切需要用无血清培养基培养细胞无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、结合蛋白、贴壁、贴壁和扩展因子和扩展因子等。等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。成。1975年，年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。和鉴定各种细胞产物的程序。向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同同 源组织的不同细胞株，所需源组织的不同细胞株，所需补加物补加物也不同。也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清添加血清 血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56，30分钟。分钟。血清的消毒：过滤除菌。血清的消毒：过滤除菌。细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。胞内形成冰晶。胞内形成冰晶。胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不 致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。晶的重结晶。晶的重结晶。晶的重结晶。低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。对细胞培养的评价对细胞培养的评价能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动有利于用其它的方法进行研究细胞有利于用其它的方法进行研究细胞可供研究的细胞种类多可供研究的细胞种类多培养的细胞携带有与体内细胞同等的基因组培养的细胞携带有与体内细胞同等的基因组易于施用物理易于施用物理,生化和生物因素进行实验生化和生物因素进行实验耗资少耗资少为生物制品为生物制品,单克隆抗体生产和基因工程制品等的单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段生产手段 体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的种类和命名 初代培养初代培养(原代培养原代培养)细胞系细胞系:经过细胞生物学鉴定经过细胞生物学鉴定,形态比较均形态比较均 一一,生长增殖比较稳定生长增殖比较稳定,生物性状清楚的细生物性状清楚的细 胞群。胞群。克隆细胞株克隆细胞株:细胞系的单个细胞增殖形成细胞系的单个细胞增殖形成的的 细胞群细胞群,称细胞株。称细胞株。体内外细胞的差异和分化 1.1.体内外细胞的差异体内外细胞的差异 2.2.培养细胞的分化培养细胞的分化 不适应性不适应性不适应性不适应性 脱分化或去分化脱分化或去分化脱分化或去分化脱分化或去分化 培养细胞与细胞，细胞与基质的关系 1.群体细胞是细胞培养的基本存在形式 2.细胞接触抑制(肿瘤细胞除外)3.对基质有依存性培养细胞的生长和增殖过程（一）培养细胞的生命期：指细胞在培养中 持续增殖和生长的时间。三个阶段：1.原代培养期 2.传代期 3.衰退期培养细胞的增殖动力学（一）增殖态（一）增殖态 G1 G1 S G2 M S G2 M （二）功能态（二）功能态(分化态分化态)G1 G1 S G2 M G0 S G2 M G0 G1 G1 S G2 M G0 S G2 M G0 -功能功能态态 功能功能态态 增殖增殖态态 （间间期）期）增殖增殖态态 （间间期）期）体内外细胞增殖和分化调控的差别1.血清在体外培养细胞增殖和分化的作用2.2.生长因子在某些体外培养细胞增殖和分化的 作用生长因子依赖型细胞：UT7细胞依赖单核巨噬细胞集落刺激因子。HMEC细胞依赖内皮细胞生长因子。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢