临床微生物学检验技术 (5).pdf

细菌耐药机制及检测总论一、细菌的耐药性 及产生机制二、细菌耐药性的检测细菌耐药性及产生机制何为细菌耐药性？耐药性亦称抗药性，是指细菌对某抗菌药物（抗生素或消毒剂）的相对抵抗性。细菌耐药性类型？（1）固有耐药（intrinsic resistance）：指细菌对某些抗菌药物的天然不敏感。源于自身染色体上的耐药基因，具有典型的种属特异性。（2）获得性耐药（acquired resistance）：指细菌DNA的改变导致其获得了耐药性表型，来源于基因突变或获得新基因。12钝化酶的产生（1）-内酰胺酶：特异性地打开药物分子结构中的-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性。当前主要由两种-内酰胺酶介导：超广谱-内酰胺酶和AmpC 内酰胺酶。（2）氨基糖苷类钝化酶：分别通过羟基磷酸化、氨基乙酰化或羧基腺苷酰化作用，使药物的分子结构发生改变，失去抗菌作用。（3）氯霉素乙酰转移酶：使氯霉素乙酰化使之失去抗菌活性。药物作用靶位的改变改变抗生素作用靶位的蛋白质结构和数量，导致其与抗生素结合的有效部位发生改变，影响药物的结合。这种改变使抗生素失去作用靶点和（或）亲和力降低。抗菌药物的渗透障碍细胞壁障碍和（或）外膜通透性的改变。生物被膜作用细菌生物被膜（bacterial biofilm BF）:是细菌为适应环境而形成的，可保护细菌逃逸抗菌药物的杀伤作用（1）抗生素难以清除BF中众多微菌落膜状物（2）BF具有多糖分子屏障和电荷屏障，阻止或延缓药物的渗透（3）BF内细菌多处于低代谢水平状态，对抗菌药物前敏感BF内部场存在一些较高浓度水解酶，使进入的抗生素失活。主动排外机制数十种细菌的外膜上有特殊的药物主动外排系统细菌耐药的生化机制细菌耐药性的检测方法1.耐药性表型检测（1）-内酰胺酶检测（2）超广谱-内酰胺酶（ESBLs）检测、AmpC酶检测、碳青霉烯酶检测（3）MRS检测克林霉素耐药葡萄球菌检测（4）氨基糖苷类高水平耐药（5）万古霉素耐药肠球菌检测2.耐药基因检验PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、DNA测序等-内酰胺酶0102内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗菌药物的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中。常见有广谱酶、超广谱内酰胺酶、金属酶、AmpC酶等。检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。-内酰胺酶03头孢硝噻吩纸片法原理：头孢硝噻吩的-内酰胺环能被-内酰胺酶所破坏，使其颜色由浅黄色变成粉红色，以此来测定细菌的产酶情况。方法：头孢硝噻吩纸片置于干净的平皿内，用无菌的牙签或接种环挑取细菌菌落涂于纸片上，观察纸片有无颜色变化。结果：纸片涂抹处如颜色由浅黄色变成粉红色，表示该菌产生-内酰胺酶。超广谱-内酰胺酶（ESBLs)超广谱-内酰胺酶ESBLs是一类由质粒介导产生的-内酰胺酶，其能水解-内酰胺酶类及单酰胺类抗生素（如头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等），并能被-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸、舒巴坦等）所抑制，并由克雷伯菌属和大肠埃希菌属产生。临床上主要有药敏纸片法、MIC法、自动仪器法、比色法、质谱法及基因检测法。项目项目初步筛选试验初步筛选试验表型确证试验表型确证试验培养基MH琼脂MH琼脂抗菌药物纸片浓度头孢泊肟 10g头孢他啶 30g头孢他啶30g头孢他啶/棒酸30/10g氨曲南 30g头孢噻肟 30g头孢噻肟 30g头孢噻肟/棒酸30/10g头孢曲松 30g接种按标准纸片扩散法的规定进行孵育条件35空气孵育时间1618h结果判读头孢泊肟17mm头孢他啶22mm氨曲南27mm头孢噻肟27mm头孢曲松25mm意味着可疑有ESBL对2个中任何一个药物，加棒酸后，抑菌环直径与不加棒酸的抑菌环相比，增大值5mm时，判定为ESBL产生原理：将药敏纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在琼脂上的扩展，观察是否出现抑菌环及抑菌环的大小，推断是否抑制细菌的生长及药物对细菌抑制作用的强弱。01纸片扩散法检测ESBLs超广谱-内酰胺酶（ESBLs)ESBLs初筛试验ESBLs确诊试验原理根据-内酰胺类抗生素加入-内酰胺酶抑制剂后最低抑菌浓度的改变来判定方法将浓度不同的头孢噻肟/克拉维酸、头孢噻肟、头孢他啶/克拉维酸、头孢他啶分别加入培养基或肉汤中混匀，观察待测菌在含不同药物浓度的培养基上的生长情况，以抑制细菌生长的平皿测得MIC值结果任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。02MIC法E试验法（E-test）：指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料纸条中向琼脂中扩散，在纸条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。03040506自动仪器法：原理同MIC法比色法：其原理是显色氧亚氨基-头孢菌素HMRZ-86不能被经典获得的青霉素酶水解，但如果超产，则会被ESBLs、MBIs和AmpC酶分解。在HMRZ-86的-内酰胺酶水解中，底物颜色由黄色变为红色或粉红色。目前比色实验包括Cica b测试、BLT测试和ESBL DNP实验。质谱法：将-内酰胺类抗生素与敏感菌株和耐药菌株共同孵育，孵育后用MALDI-TOF-MS检测抗生素水解情况，抗生素的水解导致分子质量的变化，因此可以通过质谱法快速检测到基因检测：在检出产ESBLs菌株的基础上，可以根据ESBLs基因型检测，进一步确定ESBLs的类型。超广谱-内酰胺酶（ESBLs)AmpC酶0102AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的型内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是，产AmpC酶细菌对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法，除此以外，还有硼酸化合物为抑制检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。AmpC酶-头孢西丁三维试验原理：头孢西丁敏感试验AmpC酶可以水解头孢西丁（FOX）,即产AmpC酶的菌株对头孢西丁耐药，而超广谱-内酰胺酶（ESBLs）等其他-内酰胺酶一般不能分解头孢西丁，可利用这一特性，对产AmpC酶的菌株进行初步筛选方法：制备-内酰胺酶的粗提取物三维试验：将大肠埃希菌标准菌株按NCCLS的K-B法涂布在MH平板上，在平板的中央贴一张FOX纸片，从距离纸片5cm处用无菌刀片在平板的琼脂上外缘方向（离心方向）切一裂隙（一块平板可切45条裂隙），每一裂隙中加入2530l的一种待检菌株的-内酰胺酶提取物，35培养1824h，观察裂隙的内侧端（头孢西丁纸片的抑菌环内）周围有无细菌生长。结果：裂隙的内侧端周围有细菌生长，导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性，表明该裂隙内的-内酰胺酶为AmpC酶，也就是说这种待测细菌产AmpC酶。AmpC酶-头孢西丁三维试验碳青霉烯酶碳青霉烯酶是具有水解碳青霉烯类抗菌药物活性的-内酰胺酶，主要分布于-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类-内酰胺酶。0102碳青霉烯酶原理通过利用产碳青霉烯酶菌株对碳青霉烯类抗生素的水解能力，使碳青霉烯敏感菌株在产酶菌株与碳青霉烯类纸片之间呈现锥状突起的现象方法使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ATCC 25922 菌悬液调至0.5麦氏浓度，并用生理盐水进行1：10稀释用棉签将稀释后菌液均匀涂布于MH琼脂平板上，干燥10分钟将美罗培南或亚胺培南或厄他培南纸片置于MH琼脂平板上使用1l接种环挑取3-5个过夜生长待测菌落垂直于药敏纸片从纸片边缘开始划线，长度为20-25mm352孵育16-20h结果如果在被测菌株与大肠埃希菌ATCC 25922 抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长增强，即产碳青霉烯酶。.改良Hodge试验改良Hodge试验对于检测A类KPC和D类OXA-48型碳青霉烯酶具有很好的敏感性。碳青霉烯酶.EDTA协同试验：金属酶表型检测方法原理通过细菌产生的碳青霉烯酶对美罗培南纸片的水解作用，从而使指示菌株得以繁殖方法将0.5麦氏单位的待测菌悬液均匀涂布于MH平板上在MH平板上贴一张亚胺培南（10g）纸片，在距其1cm处贴EDTA纸片（0.5mol/L 4l），35过夜培养结果亚胺培南抑菌圈在靠近加EDTA纸片侧明显扩大者为产金属酶菌株MRSMRS即对甲氧西林或苯唑西林或头孢西丁耐药的葡萄球菌。包括：MRSA（methicillin resistant staphylococci)MRCNS(methcillin resistant coagulase negative staphylococci)特点：MRS对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，常表现为多重耐药。MRS-耐药机制01耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒，SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的-内酰胺类抗菌药物亲和力下降，从而导致对这些抗菌药物的耐药。SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不同mec复合物和ccr复合物的组合，可以将SCCmec分成不同的型别，目前已发现8种SCCmec型。02MRS-检测方法MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。MRS-检测方法头孢西丁纸片扩散法方法：将金黄色葡萄球菌制成0.5麦氏单位的悬液，均匀的涂布在MH平板上贴上头孢西丁/苯唑西林药物敏感性纸片35孵育1618h量取抑菌圈直径结果：MRSA和MRSL：头孢西丁纸片抑菌环直径21mmMRSCNS（除路邓葡萄球菌）：头孢西丁抑菌环直径24mmMRS-检测方法苯唑西林-盐琼脂筛选试验方法：对含苯唑西林的琼脂平板进行“点”种将平板置于35，孵育24小时后检查有无细菌生长结果：任何生长都表示对苯唑西林耐药MRS-检测方法原理结果乳胶凝胶试验检测PBP2aMRS03检测MRS方法及选择MRS检测药物纸片法稀释法金黄色葡萄球菌1mg 苯唑西林路邓葡萄球菌1mg 苯唑西林金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌30mg 头孢西丁除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌1mg 苯唑西林30mg 头孢西丁MRS03CNS中苯唑西林MIC结果的报告策略检测无菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株耐克林霉素葡萄球菌红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制其耐药机制主要表现药物泵出和核糖体药物结合靶位的改变。机制耐药基因红霉素克林霉素核糖体修饰-药物不能结合于靶位ermRSRR（结构型）泵-药物被泵出msrARS耐克林霉素葡萄球菌对于红霉素耐药、克林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药。试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株)；对于CONS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的；大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型)；克林霉素可以口服给药。耐克林霉素葡萄球菌01D试验可诱导的克林霉素耐药试验方法将浓度为0.5麦氏单位的待测菌的悬液均匀涂布于MH琼脂平板上将红霉素和克林霉素两纸片临近贴放，两纸片边缘间距1516mm置于35孵育1824h结果若待测菌对红霉素耐药，克林霉素敏感，同时克林霉素抑菌环在靠近红霉素侧出现平截现象，即抑菌环看似大写的D时，即判为D-试验阳性，红霉素对克林霉素具有诱导性耐药若克林霉素抑菌环仍为圆形，则D-试验阴性。耐克林霉素葡萄球菌01D试验可诱导的克林霉素耐药试验诱导性克林霉素耐药（erm介导）患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药阴性阴性1526mm阳性阳性“D”无克林霉素诱导（msrA介导）真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感耐克林霉素葡萄球菌02葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法氨基糖苷类高水平耐药01氨基糖甙类抗菌药物高水平耐药（high-level aminoglycoside resistance，HLAR）肠球菌的检测培养基MH琼脂菌液浓度0.5麦氏单位孵育时间1824h药敏纸片庆大霉素（120g/片，链霉素300g/片）结果6mmHLAR，10mm敏感，79mm中介粪肠球菌ATCC2912（敏感）质控菌株链霉素：粪肠球菌ATCC51299（耐药）庆大霉素：粪肠球菌ATCC29212（敏感）粪肠球菌ATCC51299（耐药）氨基糖苷类高水平耐药02肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查 纸片扩散法120 g 庆大霉素;300 g 链霉素抑菌圈10 mm=高水平氨基糖苷类耐药 MIC筛查庆大霉素:500 g/ml 链霉素:1000 g/ml(肉汤)2000 g/ml(琼脂)03肠球菌氨基糖苷类修饰酶链霉素庆大霉素妥布霉素阿米卡星/丁胺卡那6-AAD+-3APH-+2APH/6AAC-+6AAC-+氨基糖苷类高水平耐药耐万古霉素肠球菌（VRE）01万古霉素的耐药性是由于操纵子编码的酶的存在合成低亲和力的前体，改变了万古霉素的作用位点，消除了有宿主产生的具有高亲和力的前体，从而消除了与万古霉素结合的靶位，导致了耐万古霉素肠球菌的产生。02耐万古霉素肠球菌基因分型中除 vanC 为天然性耐药基因外，其余均为获得性耐药。其中，最常见的是 vanA和 vanB、vanA 型耐药菌株对万古霉素和替考拉宁都呈诱导性高水平耐药，而 vanB型菌株则只对万古霉素呈不稳定的诱导性耐药。耐万古霉素肠球菌（VRE）0304 VRE屎肠球菌中居多vanA-高水平耐药(MIC 256 g/ml)vanB-中等水平耐药(MIC 16-256 g/ml)低水平万古霉素耐药vanC-(MIC 2-16 g/ml)vanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌菌株不引起院内爆发，vanC基因不易于传播纸片扩散法实验可能检测不出谢谢！