大鼠脑缺血再灌注模型.docx

大鼠脑缺血再灌注模型 摘 要：目的：探讨银杏达莫注射液对肾缺血-再灌注损伤的爱护作用及机制。方法：肾缺血1h再灌注1h建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，用银杏达莫注射液分别按剂量0.9、1.8、3.6mL/kg预处理7天。通过检测肾组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶的活性及血肌酐、血尿素氮的含量。电镜下视察各组肾组织的形态学改变，Western印迹法视察p38 MAPK蛋白的活化状况。结果：缺血再灌注损伤后，肾组织出现明显病理变更，肾组织丙二醛含量上升，超氧化物歧化酶活性下降，血肌酐、尿素氮水平上升，肾组织p- p38MAPK蛋白水平显著上升。银杏达莫注射液预处理能降低血肌酐、尿素氮水平及肾组织丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶活性和下调p- p38MAPK蛋白水平，与模型组比较有显著性差异（P 肾脏对缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury）极为敏感。肾移植、严峻创伤休克后延迟复苏均会导致不同程度的肾脏IRI1-2，肾缺血-再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是发生急性肾衰竭及影响移植存活的重要因素，机制非常困难。如何实行简便、有效的措施防止因肾脏IRI而导致的各种急慢性肾脏疾病，始终是国内外学者关注的重点、难点和热点。 近年来，有关器官缺血再灌注后细胞内信号通路的改变日益受到重视。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞内重要的信号转导系统之一。MAPK家族由3个主要的亚族组成：ERK、JNK/SAPK和p38MAPK。ERKs主要作为细胞促有丝分裂增殖/分化的活化因子；JNK/SAPK和p38MAPK则主要参加细胞凋亡相关蛋白的应激活化3。其中p38MAPK主要参加介导应激反应，细胞外多种应激原如放射线、紫外光、热休克、高渗液、促炎因子（如TNF-,IL-1）等都可激活p38MAPK通路4，活化后的p38MAPK以转位的方式进入细胞核，激活其下游的底物，影响细胞的增殖、分化、转化、凋亡等生物效应5。银杏达莫注射液（Ginkgo biloba extract and Dipyridamole injection，XGD）是以银杏叶提取物（EGB）为基础的复合制剂，目前已在心脑血管疾病及糖尿病防治中发挥了重要的作用，但在防治RIRI方面的探讨尚不多，值得进一步进行试验探讨。本试验利用大鼠RIRI模型，视察银杏达莫注射对RIRI的爱护作用及其对p38MAPK通路的影响，为临床应用银杏达莫注射液防治RIRI供应理论依据。 1 材料与方法 1.1 动物及试剂 健康雄性Sprague-Dawley大鼠（清洁级），体重200±20g，购自温州医学院试验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2005-0019；银杏达莫注射液（山西普德药业有限公司生产，批号：20070601），由乐清市人民医院供应；超氧化物歧化酶（SOD）丙二醛（MDA）尿素氮（BUN）肌酐（Cr）检测试剂盒及蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程探讨所。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国MBI公司。 1.2 仪 器 722N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），聚合酶链式反应DNA扩增仪（美国Bio-Rad公司），凝胶定量软件Quantity One（Bio-Rad公司），Image-pro plus 5.0彩色图像分析系统（美国Media Cybernetics公司），EXL-808酶标仪（美国Bio TeK公司）。 1.3 试验动物分组及方法 50只SD大鼠随机分为3组，每组10只。（1）比照组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；（2）模型组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；（2）银杏达莫注射液处理（高、中、低）组：按0.9、1.8、3.6mL/kg体重尾静脉注射XGD每天1次，连续7天。动物用药量是依据银杏达莫注射液的临床用药，利用大鼠与人的等效剂量换算方法计算得来。 1.4 标本收集 第8天每组大鼠经3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉胜利后，仰卧位固定，作腹部正中34cm切口，分别肾周组织，暴露双侧肾脏，游离右侧肾脏结扎肾蒂并摘除右肾。假手术组不做其他特别处理，模型组和药物处理组先用微动脉夹夹闭左肾蒂缺血1h，然后移去动脉夹再灌注1h建立缺血再灌注损伤模型。全部大鼠都经下腔静脉取血，血液标本用4000r/min高速离心机离心10min，留取上清液进行血肌酐（serum creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）检测，取肾组织分别以电镜和生化测定须要（置于液氮或-70冰箱中）保存备用。 1.5 MDA含量和SOD活性检测 用冰冷生理盐水做匀浆缓冲液制备肾组织匀浆，羟胺法测定SOD活性，TBA法测定组织MDA含量。按说明书操作试验步骤。 1.6 血清BUN和Cr含量的测定 取动物血清，二乙酰-肟法、苦味酸法分别测定血清BUN、Cr含量。试验步骤按说明书进行。 1.7 电镜检查 取大约1mm3肾上极皮质，用生理盐水冲洗后浸入2.5%戊二醛溶液中固定2h，用生理盐水冲洗3次，再用1%锇酸固定1h。经丙酮梯度脱水，环氧树脂丙酮混合液37浸泡24h，纯环氧树脂37包埋剂包埋成块，修块定位后，超薄切片（切片厚约1m-10m），电子染色，置于H-7500透射电镜下视察。 1.8 肾组织蛋白提取和蛋白印迹法（Western Blot）分析 把肾组织剪切成细小的碎片，取适量已加入PMSF的裂解液（50mM Tris （pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等），匀浆，充分裂解后，12000g离心5min，取上清，用BCA法测定总蛋白浓度后，在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分别蛋白（80g总蛋白/泳道），然后转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭2h，分别加入p-p38MAPK抗兔多克隆抗体（1800）和p38MAPK抗兔多克隆抗体（11000），4过夜。次日TBST洗膜后加入抗兔HRP抗体（13000），室温摇床2h，洗膜后ECL发光，在暗室中用X线片显影适当时间，然后冲洗胶片，扫描各种样品的蛋白条带的吸光度（A）值，并分别算出与正常比照组吸光度（A）的比值，以求出其活化倍数。 1.9 统计学处理 两组间比较采纳独立样本t检验，数据以±s表示。采纳Pearson法分析Cr、BUN、SOD、MDA与p-p38MAPK各参数间的相互关系，全部统计分析均经SPSS 13.0软件处理完成，P 表2 各组大鼠肾组织p-JNK表达的 改变及比较（n10，±s） 注：与比照组比较:P